神経血管モデリングのためのニワトリ胚性絨毛膜膜におけるヒト脳オルガノイド移植

まず、H9胚性幹細胞から脳オルガノイドを誘導し、新たに受精したニワトリ卵を得る。初日に、卵殻の表面を70%エタノールできれいにし、乾かします。卵の上に外科用紙の絆創膏を置きます。

ランプを使用して、上端の最も薄い卵殻表面を劣化させます。次に、滅菌針で卵殻にそっと穴を開けて、ひよこカムを乱すことなく空気室の穴を作ります。胚を外部環境から保護するために、空気室の穴を新しい包帯で覆い、摂氏38度で卵を孵化させます。

7日目に包帯を取り除き、卵殻の表面を70%エタノールで拭きます。次に、エクステンションを覆う新しい大きな包帯を置きます。卵の殻にそっと穴を開けて、穴を直径2センチの接ぎ木窓に広げます。

ピンセットを使用して、卵殻窓の端を取り除き、包帯をはがして、残りのほこりと卵殻片を取り除きます。滅菌ワイドゲージチップを使用して、オルガノイドを50マイクロリットルのPBSに集め、胚の位置の反対側のカムに慎重に移します。オルガノイドの周囲に7マイクロリットルのマッチゲルを滴下します。

パラフィルムを使用して窓を密閉し、絆創膏でシェルに取り付けます。カム分化のために移植をインキュベートします。5日後、絆創膏を取り除きます。

ハサミと細いピンセットを使用して、ウィンドウを拡大してサンプルの採取を容易にします。4%パラホルムアルデヒドで2分間固定し、オルガノイドを含むカムの1.5平方センチメートルの切片を採取します。移植が成功したことを確認するには、厚さ20マイクロメートルのCAM組織スライスをオルガノイドでヘマトキシリンおよびエオシン染色します。

移植片組織のヘマトキシリンとエオシン染色は、オルガノイドが血管浸潤の証拠なしにカム血管の隣で成熟し続けることを示しました。