まず、ポジティブコントロールとして作用する合成ペプチドを、DMSO中に0.1ミリグラム/ミリリットルの濃度で再懸濁します。再懸濁したペプチドをビオチン化ヒストンH4ペプチドと混合して、検量線を作成します。次に、アセチル化反応液を96ウェルPCRプレートに二重に組み立てます。
20マイクロリットルの反応液は、10マイクロリットルの酵素、1マイクロリットルのH4ペプチド、1マイクロリットルの20Xバッファー、および1マイクロリットルのDTTで構成する必要があります。各ウェルに1マイクロリットルのDMSOまたは試験化合物を添加します。混合物を静かにピペットで動かして混ぜます。
次に、混合物を氷上で10分間インキュベートし、酵素阻害剤の錯体を形成できるようにします。アセチル化反応を継続するために、2マイクロリットルの4-ペンテン油補酵素Aを4マイクロリットルの水と混ぜ合わせます。この混合物を6マイクロリットルウェルに加えます。
穏やかに混合した後、室温で300Gで30秒間遠心分離します。蓋をしたチューブの中で内容物を摂氏37度で1時間インキュベートします。内容物を20マイクロリットルの8モル尿素で急冷し、さらに処理するまで摂氏マイナス20度で保管します。
次に、80マイクロリットルのPBSTをBSAプレブロッキングした黒色のニュートラアビジンコーティング96ウェルプレートの各ウェルにピペットで移動します。40マイクロリットルの反応内容物をプレートのウェルに加えます。次に、検量線ペプチドを残りのウェルに二重にピペットで移します。
ペプチドをオービタルシェーカー上で室温で1時間静かに撹拌し、結合を促進します。結合が完了したら、ウェルから液体を吸引します。プレートウォッシャーを使用して、200マイクロリットルのPBSTでウェルを洗浄します。
クリック反応では、THPTA銅混合物を水中のアスコルビン酸ナトリウムおよびDMSO中のビオチンアジドに加えます。新たに混合した試薬19マイクロリットルを各ウェルに分注します。プレートをアルミホイルで密封します。
その後、摂氏37度で1時間インキュベートします。以前と同様に洗浄する前に、ウェルから溶液を吸引します。次に、100マイクロリットルの希釈ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ混合物を各ウェルに加えます。
オービタルシェーカーで穏やかに撹拌しながら、室温で1時間インキュベートします。Amplex Red検出試薬を組み合わせるには、500マイクロリットルの希釈過酸化水素をAmplex Red試薬にピペットで移します。この混合物50マイクロリットルを4.5ミリリットルのリン酸ナトリウムに加えます。
100マイクロリットルのAmplex Red反応混合物を洗浄ウェルにピペットで移します。次に、プレートを室温で30分間インキュベートし、光から離します。SmartControlソフトウェアを起動し、[プレートアウト]をクリックします。
プレートが装置に転送されたら、Amplex Redアイコンをクリックして、プレートのレイアウトを変更します。Amplex Redアイコンをもう一度押すと、変更されたレイアウトが表示されます。次に、レイアウトから左上の標準ウェルを選択します。
ファイル名を変更してから、調整開始を押します。ゲインを設定したら、[測定の開始]をクリックします。Current Stateを押して、リアルタイム測定を観察します。
測定が終了したら、タブを閉じます。次に、トップパネルの[最後の実行を開く]をクリックします。[Mars] タブに移動します。
次に、ホームメニューから[Excelにエクスポート]を押して、データ結果をエクスポートします。化合物 A および C は、数回の希釈液で HAT1 活性をほぼ 100% 阻害することが観察されました。
