生きたトリパノソーマ・ブルーセイのグリコソームの相対pHを測定するためのフローサイトメトリーデータの解析

YL2H チャネルまたは RL2H チャネルのヒストグラムを使用してデータを解析します。この場合、サンプルはヨウ化プロピジウムで染色されているため、YL2Hヒストグラムを使用します。次に、生細胞と死細胞を分離する二等分線ゲートを確立し、左のゲートを生細胞、右ゲートを死細胞としてラベル付けします。

このゲートをすべてのサンプルに適用して調整します。データセット内の複数のサンプルでゲートを表示して、ゲートが正しく描画されていることを確認します。染色されていない野生型コントロールで、ライブゲートをダブルクリックします。

ドットプロットのX軸を前方散布図領域に、Y軸を側面散布図領域に設定します。次に、ポリゴン ゲート ツールを使用して細胞集団の輪郭を描き、細胞にラベルを付けます。破片や死にかけている細胞や凝集体は、ドットプロットでの典型的な位置に注意して除外します。

すべてのサンプルのライブゲートの下にセルゲートを適用し、すべてのサンプルで予想される細胞集団をカバーします。未染色野生型コントロールの細胞ゲートをダブルクリックすると、このゲート内のイベントが表示されます。ドットプロットを調整するには、X軸を前方散布図領域に、Y軸を前方散乱体の高さに設定します。

このドットプロット上の単一セルの対角分布を特定し、それらをダブレットと区別します。ポリゴン ゲート ツールを使用してシングレット イベントを囲み、このゲート シングレットに名前を付けます。すべてのサンプルのセルゲートの下にシングレットゲートを適用し、シングレットを含めながらダブレットを除外し、必要に応じて異なるサンプル間でゲートを調整します。

未染色の野生型コントロールサンプルで、シングレットゲートをダブルクリックします。ドットプロットのX軸をBL1Hに、Y軸をVL2Hに変更します。ポリゴンゲートツールを使用して、対角ゲートを描画し、VL2およびBL1のフッ素-2蛍光細胞を捕捉します。

このゲートをpHL陽性としてラベル付けします。すべてのサンプルについて、シングレットゲートの下にpHLポジティブゲートを適用します。pHLゲートを調整して、野生型コントロールの自家蛍光細胞よりも高い蛍光強度を持つ細胞をカバーします。

統計をエクスポートするには、テーブルエディターをクリックし、編集バーをクリックして、最後に列の追加を選択します。合計アンゲート数、pHL陽性数、合計のライブ頻度、親のpHL陽性頻度、pHL陽性中央値VL2H、およびpHL陽性中央値BL1Hの列を組み込みます。テーブルエディタでエクスポート設定を調整するには、表示をファイルに、テキストをCSVに設定します。

ファイルの保存先と名前を選択し、「テーブルの作成」をクリックします。飢餓に反応して、時間の経過とともに緩やかな軽度の酸性化が観察され、90分で横ばいになりました。緑色の線で示したようにグルコースを再導入した後、グリコソームのpHは30分で飢餓前のレベルに戻り、グリコソームのpHがグルコースに応答して動的で調節可能であることを示唆しています。