ヒト脳オルガノイドからの単一細胞の単離によるシングルセルRNAシーケンシング

まず、人工多能性幹細胞から生成されたヒト脳オルガノイドを最大5個まで、6ウェルプレートの1ウェルに集めます。余分な培地を吸引し、オルガノイドをPBSで一度洗浄します。メスを使って、オルガノイドをしっかりとみじん切りにします。

刻んだオルガノイドに酵素ミックス1を加え、20%の酸素と5%の二酸化炭素を摂氏37度で90 RPMで10〜15分間インキュベートします。オルガノイド懸濁液を1000マイクロリットルのピペットチップを使用して混合します。次に、酵素ミックスを2つ加え、摂氏37度で10〜15分間インキュベートします。

10ミリリットルの停止溶液を追加することで解離を停止します。70ミクロンの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。ろ過した細胞懸濁液を300 Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。

上清を吸引し、ペレットを4ミリリットルの冷たい0.04%BSAに再懸濁します。次に、40ミクロンのセルストレーナーで細胞懸濁液をろ過し、セルカウンターで細胞をカウントします。必要な量の細胞懸濁液を遠心分離し、上清を吸引し、マイクロ流体ベースのscRNA-Seqキットマニュアルに従ってペレットをNSB plus培地に再懸濁します。