単一核RNAシーケンシングのためのヒト脳オルガノイドからの単一核の単離

まず、人工多能性幹細胞から作製した4つのヒト脳オルガノイドを、チルドPBSを含む6ウェルプレートに移します。各オルガノイドを4つに切ります。はさみを使用して、1, 000マイクロリットルのピペットチップの先端を切り取り、それを使用してオルガノイド片を2ミリリットルのダウンサーに移します。

PBSを完全に吸引し、NP-40溶解バッファーを1ミリリットル加えます。オルガノイドを3回、乳棒A、続いて乳棒Bで3回転がし、懸濁液を15ミリリットルの遠心分離管に移します。1ミリリットルの溶解緩衝液でダウンサーを洗浄し、溶液を遠心分離管に移します。

室温で5分間インキュベートした後、オルガノイド懸濁液を500 Gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、チューブ内に50マイクロリットルを残します。1ミリリットルのNSB Plus培地をチューブに加えます。

そして5分後、ペレットを再懸濁するために混合します。チューブ内にPercollグラジエントを調製した後、その上にオルガノイド懸濁液を重ねます。次に、層状オルガノイド懸濁液を500 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清を吸引し、ペレットをNSB Plus培地に再懸濁します。40ミクロンのセルストレーナーで核溶液をろ過します。次に、DAPIを使用して核を染色し、ノイバウアーチャンバーでそれらをカウントします。

必要な量の核溶液を遠心分離し、マイクロ流体ベースのsnRNA-seqキットマニュアルに従って、ペレットをNSB Plus培地に再懸濁します。