まず、大腸菌を5ミリリットルのルリア・ベルタニ(LB)培地で、滅菌ポリスチレンまたはガラス培養チューブで培養します。チューブを摂氏37度で一晩インキュベートし、200RPMで振とうします。継代培養は、円錐フラスコ中で100ミリリットルLBで一晩培養した培養物1〜50個です。
培養液を摂氏37度、200RPMで約1.5時間インキュベートします。次に、100マイクロリットルの高力価T4ファージストックを大腸菌培養物に加え、摂氏37度で3時間振とうしながらインキュベートします。T4ファージライセートが透明になったら、50ミリリットルのコニカルチューブに集めます。
ライセートを 4, 000 g で 20 分間遠心分離し、残っているバクテリアや細胞破片をペレット化します。得られた上清を0.22ミクロンのナイロンフィルターでろ過滅菌し、濾液を新しい50ミリリットルのチューブに回収します。ろ過したT4ファージライセートに0.1容量のクロロホルムを添加して、残りの細菌を死滅させ、細菌の増殖を防ぎます。
短時間ボルテックスし、ライセートを室温で10分間インキュベートします。ライセートを4, 000gで5分間遠心分離し、ライセートからクロロホルムを分離します。血清ピペットを使用して、上部のライセート層を新しい50ミリリットルのチューブに慎重に移します。
100キロダルトンの遠心フィルター装置の上部リザーバーに13ミリリットルのファージライセートを加えます。ライセートを4, 000gで5分間、またはライセートのほとんどがフィルターを通過するまで濃縮します。P200またはP1000ピペットを使用して、残りの2ミリリットルのライセートを上部リザーバー内で上下に静かにピペットで移し、フィルターメンブレンの詰まりを取り除きます。
下部リザーバーからの濾液を廃棄物容器に廃棄します。濃縮を繰り返し、上部リザーバーに約2ミリリットルの濃縮ファージを保持します。最後のスピン後、残りのライセートを上部リザーバーでゆっくりと上下にピペットします。
ファージ溶解液を洗浄するには、12ミリリットルの生理食塩水マグネシウム(SM)緩衝液を上部リザーバーに加え、4, 000 gで10分間遠心分離します。2回目の洗浄後、残りの2 mLのライセートをSMバッファーに再懸濁し、最終容量が10 mLになるようにします。ライセートを50ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で保存します。
汚染されたエンドトキシンを除去するには、ライセートの総容量に0.4容量の1-オクタノールを添加します。チューブの蓋をシールフィルムで密封し、120RPMで1時間振とうした後、摂氏4度で1.5時間振とうせずにインキュベートします。遠心分離機でエンドトキシン除去ライセートを1-オクタノールから分離します。
P1000ピペットを使用して、できるだけ多くの1-オクタノールを慎重に除去し、適切な廃液容器に廃棄します。18ゲージの針と10ミリリットルのシリンジを使用して、残りの1-オクタノール層の下にファージライセートを回収します。T4ファージライセートの1ミリリットルアリコートを滅菌1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
蓋を4, 000 gで開いた状態でチューブを速度真空にして、ライセートから残留1-オクタノールを蒸発させます。ファージライセートを10倍に段階希釈し、各希釈液の5マイクロリットルをLB寒天プレートにスポットし、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、プラークを数えてプラーク形成単位(PFU)を計算します。
得られたライセートとSM緩衝液を所望の濃度に希釈し、リタイターして確認します。濃縮ライセートは、使用するまで摂氏4度で保管してください。
