糞便スポットプレーティングアッセイを用いたマウスにおけるT4ファージのin vivoモニタリングと定量

まず、T4ファージを接種した大腸菌モノコロニーマウスから糞便ペレットを、滅菌済みの計量済みマイクロ遠心チューブに採取します。チューブの最終重量を記録し、初期チューブ重量を差し引いてサンプル重量を計算します。1ミリリットルの滅菌SM緩衝液をチューブに加え、最高速度でボルテックスして糞便ペレットを均質化します。

コロニー形成単位またはグラムあたりのCFUまたはPFUの計算のために、各サンプルに添加されたSMバッファーの量を記録します。180マイクロリットルのSM緩衝液で各サンプルを20マイクロリットルずつ、8回連続希釈して調製します。T4バクテリオファージと大腸菌の濃度を決定するために、大腸菌またはLB寒天プレートのみを含むLB寒天プレートに各希釈液の5マイクロリットルをスポットします。

各スポットを乾燥させてからプレートを反転させ、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、スポットごとに3〜30個の可算プラークで希釈を選択します。使用したプラークと希釈液の数を数えて記録します。

プラークの数を各スポットにメッキされた体積で割って、マイクロリットルあたりのPFUを求めます。これに希釈係数と、サンプルあたりのPFUの各サンプルに添加されたSMバッファーの量を掛けます。最後に、サンプル重量で割って、サンプル1グラムあたりのPFUを求めます。

T4ファージと大腸菌のレベルは、T4ファージまたはビヒクルライセートの6番目のPFUに2×10で注射されたマウスで検出され、4週間にわたってどちらの集団も枯渇することなく、T4ファージと大腸菌の共存を示しました。低用量のT4ファージは、2×10から6番目のPFUと比較してコロニー形成に影響を与えず、大腸菌レベルに対する用量依存的な影響は観察されなかった。