まず、ダイヤモンドペンシルを使用して、標準的なガラスカバースリップを3等分します。真空グリースを使用して、カバースリップストリップの一部を自家製のチャンバーホルダーの底に貼り付けます。同様に、カバースリップストリップの2番目のピースをチャンバーホルダーの上部に取り付けます。
次に、ピペットガンを使用して、200マイクロリットルのラベル付きRBC懸濁液を2つのカバースリップの間に注入します。マイクロピペット吸引装置を組み立てるには、細胞チャンバーを顕微鏡プラットフォームのホルダーステージに取り付けます。チャンバーの位置を対物レンズの真下になるまで調整します。
次に、接続されている貯水槽の液面を下回るまでホルダーを下げます。脱塩した水をマイクロピペットに注入し、34ゲージの針を備えたシリンジを使用して気泡を取り除きます。マイクロピペットホルダーの端を半分ほど緩め、ホルダーから数秒間水が滴り落ちるのを待ちます。
次に、懸濁液を充填したマイクロピペットをホルダーチップに挿入し、ホルダーネジを締めます。マイクロピペットをセルチャンバーに入れます。次に、ピペットと赤血球を顕微鏡で見つけます。
ピペットチップを下げて、配置されたRBCと水平になっていることを確認します。貯水池の高さを調整して、先端の油圧をゼロにします。次に、貯水池を少し上げて、微妙な陽圧を発生させます。
488ナノメートルの蛍光励起光源をONにします。蛍光灯カメラと透過カメラの電源を入れます。対応するソフトウェアで、両方のカメラの露光時間、関心領域、およびビニングサイズを入力します。
次に、[Multi-Dimensional Acquisition]パネルで取得番号を2000に設定します。必要な保存ディレクトリを選択します。次に、マイクロマニピュレーターの助けを借りてマイクロピペットを見つけます。
空気圧クランプをオンにして、コントロールボックスが外部モードになっていることを確認します。ノブをゆっくりと回して、システム内のオフセット圧力を補正します。空圧クランプを制御するソフトウェアを起動します。
電気制御パネルを使用して、20ミリボルト/ミリメートルの水銀変換係数で圧力を制御し続けます。次に、システム内の圧力をゼロにし、マイクロピペットを赤血球の近くに慎重に移動させ、貯水槽の位置を調整して、マイクロピペットの先端に微妙な陽圧を発生させます。
カメラソフトウェアで撮影を開始し、蛍光シャッターをオンにします。計算された電圧の大きさをコントロールパネルに入力して、目的の圧力に到達し、RBCを吸引します。あらかじめ設定した期間圧力を保持してから、解放します。
同様に、さらに分析する前に、次の赤血球で実験を繰り返します。圧力が徐々に上昇すると、赤血球へのカルシウムイオンの動員が増加しました。
