まず、10ミリリットルの2X AlkB反応バッファーを調製し、0.2ミクロンのシリンジフィルターで滅菌します。滅菌PCRチューブに、リンカー1-ライゲーションRNAを20マイクロリットル、2X AlkB反応バッファーを50マイクロリットル、AlkBデメチラーゼを2マイクロリットル、RNA阻害剤を1マイクロリットル、および27マイクロリットルのRNAフリーウォーターを加えて、AlkB消化反応を調製します。AlkB消化混合物を室温で2時間インキュベートし、RNAから転写後メチル化を除去します。
クリーンな相分離のために、50マイクロリットルのRNAフリー水をAlkB反応に加えます。次に、100マイクロリットルのフェノール、クロロホルム、およびイソアミルアルコール混合物を追加します。チューブを10秒間振ってください。
AlkB混合物を16, 000Gで10分間遠心分離します。上部水層含有RNAの約140マイクロリットルを滅菌済みの1.5ミリリットルチューブに移します。残留フェノールを除去するには、抽出したRNAに100マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを振とうします。
混合物を16, 000Gで10分間遠心分離し、上部の水層の約120マイクロリットルを滅菌1.5ミリリットルのチューブに移します。逆転写反応後、1マイクロリットルの5モル水酸化ナトリウムをRNA cDNAハイブリッドに加えます。93°Cで3分間インキュベートし、RNA cDNAハイブリッドのRNA鎖を加水分解します。
次に、0.77マイクロリットルの5モル塩酸を加えて反応を中和します。TAEバッファーに3%アガロースゲルを調製します。1マイクロリットルの6Xローディング色素を5マイクロリットルのPCR産物に混合し、その混合物をゲルにロードします。
5マイクロリットルの50塩基または100塩基対のDNAラダーを、最初のサンプルの前のウェルと最後のサンプルの後のウェルにロードします。120ボルト、400ミリアンペアで75分間ゲル電気泳動を行い、PCR産物を見つけます。電気泳動後、ゲルを箱に入れ、ゲルが完全に浸るまで脱イオン水で満たします。
10マイクロリットルの臭化エチジウムを水に加えます。箱をホイルで包み、シェーカーで30分間染色します。エチジウムブロマイド含有水は、ドラフトに入れた廃棄物ボトルに捨てます。
ゲルを脱イオン水で一度すすぎ、水を廃液ボトルに捨てます。ゲルを脱イオン水で10分間洗浄した後、ゲルイメージャーを使用してバンドを視覚化し、ゲルの高解像度画像を取得します。
