Candida glabrataのエチジウムブロマイド誘導プチコロニーにおけるミトコンドリア機能解析

カンジダ・グラブラタの培養を開始するには、作業プラットフォームにすべての実験材料を配置します。酵母ペプトンデキストロースまたはYPD寒天プレートからC.glabrataの単一のコロニーを選択します。そして、それを3ミリリットルのYPD培地を含むガラス試験管に移します。

155 RPMで振とうしながら、摂氏25度で14〜16時間インキュベートします。インキュベーション後、培養物を新鮮なYPDで希釈して、600ナノメートルの0.1の光学密度を得る。希釈した培養物を25°Cで6時間インキュベートし、155RPMで振とうします。

YPDから3ミリリットルの0.1ナノメートルの600ナノメートルの光学密度に酵母懸濁液を調製する。30マイクロリットルの臭化エチジウムストックを加え、酵母懸濁液を摂氏25度、155 RPMで45度の角度で一晩インキュベートします。翌日、新鮮なYPD培地で培養の光学濃度を0.65に調整します。

96ウェルプレートで、20マイクロリットルの酵母懸濁液をウェルあたり180マイクロリットルのPBSに加えて、10倍に希釈します。YPD寒天プレートの4つの象限に各希釈液20マイクロリットルをプレートします。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、5〜80コロニーの象限を選択し、20マイクロリットルの20%トリフェニルテトラゾリウムを追加します。そして、20マイクロリットルの20%トリフェニルテトラゾリウムクロリドを各コロニーの中心に直接加えます。プレートを摂氏37度で30〜40分間インキュベートします。

48ビットフルカラー光学スキャナーを使用して、1200DPIでプレートをスキャンします。DNAインターカレート剤である臭化エチジウムは、C.glabrataのプチ変異体を効果的に誘導します。