各サンプルについて、1ミリリットルのLBブロスと1つのLBとゲンタマイシン寒天プレートを予熱し、摂氏37度に設定した静的インキュベーターでコントロールします。合計容量が5マイクロリットル以下の場合、pTNS2ヘルパープラスミドとpUC18-Tmini-Tn7-TlacゲンタマイシンadeIJK挿入プラスミドをそれぞれ100〜200ナノグラムをエレクトロコンピテントセルのアリコートに添加します。指先で軽く叩いて混合し、気泡を発生させることなくプラスミドとエレクトロコンピテントセルを完全に混合します。
等量の滅菌蒸留水をネガティブコントロールセルのアリコートに加え、前に示すように穏やかに混合します。サンプルを氷上で20分間インキュベートします。細胞サンプル全体を氷冷エレクトロポレーションキュベットに移し、キュベットを氷上に戻します。
細胞サンプルをエレクトロポレーションするには、エレクトロポレーターをオンにして2キロボルトに設定します。キュベットの表面を柔らかいティッシュで拭いて、付着した氷や湿気を取り除きます。キュベットをエレクトロポレーターに挿入し、電気ショックを与えます。
ただちに0.9ミリリットルの予熱したLBブロスをキュベット内の細胞に加え、ピペットで静かに上下させて細胞を培地と混合します。細胞懸濁液全体を室温で新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。次に、エレクトロポレーターの時定数値を確認します。
最良の結果を得るには、この値を 4 から 6 の間に設定する必要があります。エレクトロポレーションしたサンプルを摂氏37度、250 RPMで1時間インキュベートし、細胞の回収を可能にします。1時間後、接種用スプレッダーを使用して、各サンプル100マイクロリットルを予め温めたLBプラスゲンタマイシン寒天プレートに広げます。
プレートを摂氏37度で16〜18時間インキュベートします。エレクトロポレーションプレートを確認してください。滅菌爪楊枝を使用して、LBプラスゲンタマイシン寒天プレートから最大10個の単一コロニーをピックアップし、それらを新しいLBプラスゲンタマイシン寒天プレートにパッチします。
プレートを摂氏37度で16〜18時間インキュベートします。形質転換プレートコロニーを選択培地にパッチングすることで、形質転換株が保存され、コロニーPCRスクリーニングの出発物質が得られます。スクリーニングプライマー、ABglmS2フォワードニュー、およびTn7リバースのPCR産物は382塩基対です。
反応のネガティブコントロールには、野生型A.baumannii ATCC 17978、AB 258、およびテンプレートなしが含まれます。
