まず、培養細胞から清澄化したウイルスを入手します。超遠心チューブをマルチチャンネルペリスタルティックポンプの出力側のラックに配置します。血清ピペットを使用して、10ミリリットルの清澄化ウイルスを各超遠心チューブに慎重に分注します。
次に、22ミリリットルの15%イオジキサノール画分を清潔な50ミリリットルのコニカルチューブに移します。ポンプの右側にあるキャピラリーをチューブに入れ、ポンプを始動します。ポンプを停止します。
ヨウジキサノール画分がポンプの出力側のキャピラリーの末端に達したら、清澄化したウイルスが入った各超遠心チューブに出力キャピラリーを挿入し、ポンプを始動します。最後の15%フラクションが入力キャピラリーに取り込まれる寸前になったら、ポンプを停止します。次に、22ミリリットルの25%イオジキサノール画分を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。
ポンプをオンにした後、フラクション全体をインプットキャピラリーに取り込み、ポンプを停止します。必要に応じて、60%フラクションをさらに添加し、ライセートが上にドームを作り、オーバーフローしなくなるまで各チューブを充填します。ポンプを停止し、出力キャピラリーを慎重に取り外します。
超遠心チューブをスペーサーでキャップし、タイプ70 TIローターにロードします。遠心分離後、超遠心チューブをサポートスタンドにクランプします。糸くずの出ないワイプを使用して、超遠心チューブからキャップを取り外します。
次に、20ゲージの針を5ミリリットルのシリンジに取り付け、40%と60%のイオジキサノール界面の約3ミリリットル下の針で超遠心チューブの壁を貫通します。界面と40%フラクションの一部をゆっくりと吸引します。超遠心チューブの開いた上部を指1本で押さえ、シリンジを引き出し、吸引したAAV画分を50ミリリットルのコニカルチューブに移します。
最後に、吸引したウイルス画分をAAV溶解緩衝液で2倍に希釈し、40ミリリットルの容量にします。蠕動チューブをフラッシングした後、20 mLの希釈したAAVフラクションを新しい超遠心チューブにロードし、2回目のフラクションを行います。
