生物発光アッセイのためのヒト腸腸内エンテロイド培養の最適化

まず、ヒト腸内エンテロイド(HIE)を作業プラットフォームに通過するために必要なすべての材料を配置します。HIEを成長因子を減少させた3D培養マトリックスと混合します。ウェルあたり10マイクロリットルの3D培養マトリックスの液滴3個を入れた24ウェルプレートに混合物を播種し、摂氏37度で20分間インキュベートします。

次に、350マイクロリットルのHIE成長培地を追加します。7日後、4つのウェルからHIEを1.5ミリリットルのチューブに収集します。HIEを2000gで40秒間遠心分離し、破片を取り除きます。

ピペットを使用して、チューブから余分な3D培養マトリックスを取り除きます。0.5ミリリットルの冷たいPBSをチューブに加えます。1ミリリットルのインスリン注射器を使用して、HIEsを解離するために最大10回注射して物理的な乱流を適用します。

解離したHIEを2000gで40秒間遠心分離し、上清を静かに除去します。次に、チューブを氷の上に約3分間置きます。成長因子を還元した3D培養マトリックスをチューブに添加し、ペレットと混合します。

3D培養マトリックスのHIEの混合物を、35ミリメートルの丸い皿の中心に播種します。皿を摂氏37度で20分間インキュベートし、3D培養マトリックスを固めます。次に、あらかじめ温めた腸管オルガノイド増殖培地2ミリリットルを皿に加え、5%の二酸化炭素と摂氏37度で48時間インキュベートします。

3日目に、増殖培地を2ミリリットルの予熱した分化培地と交換し、5%二酸化炭素と摂氏37度で48時間インキュベートします。5日目に、エンテロイド培地を2ミリリットルの予熱した分化培地と交換し、24時間インキュベーションを続けます。