まず、分化したHIEを含むディッシュをインキュベーターから取り出します。エンテロイドの分子時計を同期させるには、2マイクロリットルの100マイクロモルのデキサメタゾンを皿に加え、5%の二酸化炭素と摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション中に、ルミノメーターの二酸化炭素の割合と温度をそれぞれ摂氏5%と37°Cに設定します。
クロック同期後、200マイクロモルのD-Luciferを含む3ミリリットルの予温分化培地をエンテロイドに補充します。ディッシュをインキュベーションルミノメーターの8ウェルディッシュテーブルに置き、サンプルディッシュテーブルを蓋で覆います。湿ったティッシュまたはスポンジを入れた2つの加湿器チャンバーをサンプルディッシュテーブルの上部に置き、機械の蓋を閉めます。
生物発光ソフトウェアで、コンディションタブをクリックして、ディッシュ数、測定時間、バックグラウンド処理、フィルタータイプの設定を調整します。次に、[OK]をクリックして設定を保存します。実験を開始するには、[実行] タブをクリックし、次に [開始] ボタンをクリックします。
次に、画面上部の生のノイズフィルタリングまたはトレンド除去のタブをクリックして、選択したデータの信号を観察します。録音後、停止ボタンをクリックして実行を停止します。[ファイル]タブに移動し、[名前を付けて保存]を選択して、データをKronos形式で保存します。
最後に、[ファイル]をクリックし、[Excel形式としてエクスポート]を選択して、データをスプレッドシートにエクスポートします。生物発光記録は、幹細胞が濃縮され分化誘導条件下でのHIEの概日リズム性を評価しました。高速な4年間の変換解析により、分化条件下で、B MAL1ルシフェラーゼ生物発光は平均周期22.92時間という強力な概日振動を示すことが明らかになりました。
対照的に、HIEは幹細胞が豊富な条件で概日リズムの乱れを示しました。
