まず、PBS溶液に500倍のオレンジ色素を添加してさまざまな色素比を実現し、デスクトップでデータ収集ソフトウェアを起動します。「装置」をクリックし、対応するマイクロプレートモデルを選択して、「OK」を選択します。Acquisition settingsをクリックし、Fluorescenceを選択します。
波長インターフェースの下で、ラムダ 1 を 470 ナノメートルと 570 ナノメートルに設定し、[OK] を押します。オレンジ色の染料の各濃度の100マイクロリットルを96ウェルプレートのウェルにピペットで移します。プレートを蛍光マイクロプレートリーダー装置の検出ステージに置きます。
ソフトウェアのReadアイコンをクリックし、各色素濃度の蛍光を室温で2分間隔で13回測定します。各決定後、「エクスポート」アイコンをクリックし、「XML XLS TXTにエクスポート」を選択します。[すべてのプレート] を選択します。
次に、出力形式で[プレート]を選択し、[OK]をクリックしてデータをXLS形式で保存し、さらに分析します。次に、デジタル加熱シェーキングドライバスをオンにします。加熱温度を摂氏35度に、加熱時間を2分に設定します。
1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで染料の最適な希釈比を調製します。次に、デジタル加熱振とうドライバスに2分間入れます。次に、PBSと染色液の両方を100マイクロリットルプレートのウェルに加えます。
プレートを検出ステージにセットします。Data AcquisitionソフトウェアのReadアイコンをクリックします。加熱温度を摂氏40度に、加熱時間を2分に設定します。
次に、プレート内の染料溶液をピペットで1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに戻します。デジタル加熱振とうドライバスで2分間加熱します。色素溶液の添加を繰り返し、結果のデータをエクスポートして、摂氏35度から95度までの5度の温度刻みで色素溶液の吸光度をテストします。
CD40タンパク質溶液をPBSと組み合わせ、マイクロリットルあたり5、10、15、および20マイクログラムの最終濃度を取得します。次に、PBSとオレンジ染料を組み合わせ、1の最終濃度が500になるようにします。CD40タンパク質溶液の吸光度を、摂氏35度から95度まで5度刻みで評価します。
データをXLSファイルとして保存し、Data Analysisソフトウェアを使用して融点またはTM値を計算します。次に、CD40とウンベリフェロンをPBS溶液に混合します。次に、オレンジ色の染料をPBSにピペットで移し、溶液濃度が1になるようにします。
CD40 Umbelliferone複合体溶液の吸光度を、摂氏35度から95度までの5度の温度刻みで測定します。オレンジ色の色素は、室温と高温の両方で一貫して安定した蛍光励起を示しました。1つの最適な希釈倍率は500に対して、決定した。
1ミリリットルあたり15マイクログラムの濃度で摂氏51.82度の安定したTM値が検出されましたが、CD40タンパク質濃度の増加に伴って摂氏45.79度に減少しました。
