タンパク質間相互作用研究のためのエピトープタグ沈殿タンパク質の溶出とイムノブロッティング

エピトープタグ付きタンパク質サンプルを5, 000Gで摂氏4度で30秒間遠心分離します。氷の上で1分間待って、ビーズが水平になるまで待ちます。次に、上清を捨てます。

プロテアーゼ阻害剤を含むタンパク質溶解バッファー1ミリリットルをチューブに加え、内容物を混合します。ローテーターでチューブを約30秒サイクル、摂氏4度で5分間回転させます。再び遠心分離機にかけ、チューブを氷の上に1分間置き、ビーズを平らにしてから上清を捨てます。

次に、10マイクロリットルのサンプルバッファーを加え、サンプルを摂氏98度で10分間沸騰させます。サンプルを5, 000Gで摂氏4度で30秒間遠心分離します。タンパク質吸収率の低い新しいチューブにカラムを入れ、先端がカットされたピペットを使用してゲルをカラムに移します。

9、730Gで摂氏4度で1分間遠心分離し、フロースルーを収集します。ゲルを電気泳動チャンバーに入れ、トリス-グリシン-SDSバッファーをゲルの周囲に適切な容量まで加えます。溶出したタンパク質サンプルをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにロードします。

100ボルトと400ミリアンペアで電気泳動を行います。ゲルをポリフッ化ビニリデンメンブレンに移し、メンブレンブロットを5%スキムミルクで室温で1時間ブロットします。シェーカーでPBSポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを使用してメンブレンを最高速度で5分間3回洗浄します。

最後に、メンブレンを一次抗体とともに摂氏4度のシェーカーで一晩インキュベートします。トランスフェクションされたHEK 293細胞において、イムノブロッティングにより、DYKDDDDK-PRDM16およびHA-EHMT1をトランスフェクションした群において、DYKDDDDK-PRDM16とHA-EHMT1との関連が確認されました。