まず、PEG沈殿させたアデノ随伴ウイルスHEK293培養物全体を大きな円錐形チューブに移します。培養物を2, 820gで摂氏4度で15分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットをカルシウムとマグネシウムを含む15ミリリットルのPBSに再懸濁します。
再懸濁した部品を50ミリリットルのチューブに移します。10ミリリットルのPBSを加えて残りのPEG沈殿物を回収し、すべてを50ミリリットルのチューブに移します。次に、40マイクロリットルのDNase Iを加え、摂氏37度で1時間インキュベートします。
ガラス製のパスツールピペットを使用して、25 mm x 89 mmのポリアロマーチューブに15.5 mmリットルの濃縮細胞ライセートを充填します。新しいガラス製のパスツールピペットを使用して、9ミリリットルの15%ヨジキサノール溶液を細胞ライセートの下に静かに注入します。次に、5ミリリットルの25%および40%イオジキサノール溶液を加えます。
そして最後に、5ミリリットルの60%ヨジキサノール溶液を加えます。シリンジを使用してチューブにPBSを充填し、ヨジキサノール層を乱すことなくほとんどの気泡が除去されるようにします。電気チューブトッパーを使用してチューブを密封します。
ヨジキサノールグラジエントの異なる層がはっきりと見えることを確認してください。490 、 000 g の非スイングローターを使用して、摂氏 16 度で 1 時間 10 分間チューブを遠心分離します。遠心分離したら、チューブを金属製の留め金で組み立てます。
シリンジに19ゲージの針を取り付けます。次に、30ゲージの針を使用してチューブの上部に穴を開け、針を挿入したままにします。フェノールレッドのインジケーターで示されているように、40%60%iodixanol界面のすぐ下のチューブに慎重に穴を開けます。
針の斜角が40%層に面していることを確認します。利き手でない方の手で30ゲージの針を外し、ウイルスとヨジキサノールの混合物をゆっくりと抽出します。半分ほどで、ベベルの針を下向きに回転させ、タンパク質層からの収集を避けながら抽出を続けます。
抜歯後、直ちに超遠心チューブを50ミリリットルのチューブに移して廃棄してください。収集したAAV-ヨジキサノール懸濁液を15ミリリットルのチューブに加え、PBSで5倍に希釈し、最大15ミリリットルまで充填します。懸濁液を遠心フィルターチューブに移し、3, 428gで摂氏4度で10分間遠心分離する。
フロースルーを廃棄した後、15ミリリットルのPBS 5%スクロースを濾液に加え、再懸濁します。遠心フィルターチューブから濃縮AAVを回収します。最後に、ウイルスアリコートを摂氏4度で最大3か月間保存します。
