まず、飢餓状態のL1ステージCaenorhabditis elegans幼虫が占める線虫増殖培地またはNGMプレートを選択します。1ミリリットルの滅菌水を使用して、プレートからワームをやさしく洗い流します。約300マイクロリットルの線虫を、濃縮OP50を播種したNGMプレートに分注します。
プレートドライヤーまたはブンゼンバーナーを使用してプレートを乾燥させ、その後、かなりの個体群が妊娠した成体になるまで摂氏20度でインキュベートします。ワームを収集するには、最大10ミリリットルの滅菌水でプレートから洗い流し、温水混合物を15ミリリットルの円錐形チューブに移します。ウォームが重力によってチューブの底に約4分間落ち着くのを待ちます。
小さなピペットチップを使用して、上清を慎重に吸引して捨てます。次に、最大15ミリリットルの滅菌水を追加します。最終洗浄後、上清を取り除き、新たに調製した漂白剤と水酸化ナトリウムの溶液を5ミリリットル加えます。
ワームを室温で5分間インキュベートし、1分ごとに少なくとも10秒間ボルテックスします。解剖顕微鏡を使用して進行状況を監視します。すべての成虫が割れたり溶解したりしたら、M9バッファーを添加して反応を中和し、最終容量を15ミリリットルにします。
次に、チューブを1,300Gで2分間遠心分離し、遠心分離により13ミリリットルのM9バッファーで卵をさらに2回洗浄し、続いて15ミリリットルのS完全バッファーで1回洗浄します。その後、卵を1, 300 G.After遠心分離後、上清を吸引し、10ミリリットルのS完全緩衝液を加えます。ミューテーターまたは同様のデバイスを使用して、チューブを室温で一晩中静かに回転させます。
解剖顕微鏡を使用して、ワームが孵化したかどうかを評価します。顕微鏡下で10マイクロリットルのSバッファー液中の線虫を数えます。カルベニシリン、アムホテリシンB、およびOP50を含むS完全培地に、ミリリットルあたり60のワームを含む液体ワーム混合物を調製します。
120マイクロリットルの媒体を列AからGに増やし、行Hに中ワームなしの媒体を加え、汚染と蒸発を防ぐためにテープシーラーでプレートを密封します。密封されたプレートを摂氏20度で約65時間インキュベートし、動物がL4ワームになるまでインキュベートします。各ウェルに30マイクロリットルの0.6ミリモルフルオロデオキシウリジンストック溶液を加えて、L4段階で動物を滅菌します。
テープシーラーを使用してプレートを再シールし、マイクロタイタープレートシェーカーで800RPMで20分間撹拌します。プレートを摂氏20度のインキュベーターに戻します。翌日、興味のある薬を1日目の文化に追加します。
プレートをテープシーラーで再シールし、プレートシェーカーで800RPMで20分間振とうします。次に、蓋とシールを取り外した後、プレートリーダーでOD600を測定し、初日の測定を行います。プレートを再シールし、摂氏20度のインキュベーターに戻します。
倒立顕微鏡を使用して、できれば2倍の対物レンズを使用して、各ウェルの線虫の個体数をカウントし、その数をスプレッドシートに記録します。カウント後、プレートを摂氏20度のインキュベーターに戻します。用量反応曲線のセロトニン濃度の関数としての食物摂取量の完全な変化は、N2株が用量依存的に過食できることを示しました。
daf-16 mu86変異体は、N2よりも高い基礎摂食を示します。しかし、N2株と同じ用量依存的にセロトニンに反応することはできません。ロキサピンで処理されたが、X線、ガンマ線、またはパラホルムアルデヒドのいずれかによって死滅した細菌が供給された線虫の食物摂取量には有意差が観察されました。一連の遺伝的系統の食物摂取量の比較は、exc-4およびcgr-1変異体が食べる量が少なく、srp-6変異体が食べる量が多いことを示しました。
