まず、安楽死させたマウスを仰臥位にして解剖ボードに置きます。解剖Tピンを使用して、マウスのフットパッドをボードに固定します。外科解剖ハサミで下腹部を切開し、あごまで切り込みます。
皮膚を腹膜の内壁から分離した後、皮膚を体幹から垂直に伸ばして固定します。鈍い鉗子を使用して、頸椎、軸、上腕、鼠径部のリンパ節、および脾臓を慎重に切除し、2ミリリットルのR9培地を含む70マイクロメートルのセルストレーナーに入れます。単一細胞懸濁液を調製するには、組織破壊ツールを時計回りと反時計回りに繰り返し半回転させます。
ストレーナーを5ミリリットルのメディアで洗います。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離します。上清をデカントした後、500マイクロリットルの溶解バッファーをチューブに追加して赤血球を除去します。
1分後、セルを9.5ミリリットルのR9培地と混合します。チューブを遠心分離します。そして、上澄みをしっかりとデカントします。
次に、抗MHC2抗体および抗CD4抗体を含むネガティブセレクション培地10ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁し、チューブをロッカーに30分間置く。細胞を270Gで5分間ペレット化した後、上清をデカントします。同時に15ミリリットルのコニカルチューブで、200マイクロリットルの羊抗ラットおよび免疫グロブリンGビーズを7ミリリットルの培地で洗浄します。
チューブを磁石の上に置き、媒体を取り除きます。さらに2回洗浄した後、ビーズを7ミリリットルのR9培地に再懸濁します。次に、7ミリリットルのビーズ懸濁液を細胞ペレットと混合し、ロッカー上でチューブをインキュベートします。
抗体ビーズ結合細胞を除去するには、コニカルチューブを磁石に直接3分間置きます。細胞懸濁液を新しい15ミリリットルチューブに吸引し、チューブを磁石に保持します。濃縮されたCD8陽性細胞をペレット化し、培地で3回洗浄します。
