滅菌したチューブをバイオチップに接続する前に、まずチューブを200マイクロリットルのPBSで洗い流し、次に200マイクロリットルのEC培地で洗い流します。新たに調製した細胞培養培地で上部チャンバーと下部チャンバーを洗い流した後、バイオチップの出口側にリザーバーを挿入し、チューブ付きのリザーバーをバイオチップの入口に接続します。円形の培地を増殖させるには、チューブをリザーバーとバイオチップに接続します。
次に、リザーバーに500マイクロリットルのEC培地を入れます。バイオチップをチューブに接続して、毎分21マイクロリットルの流量で増殖を開始します。翌日、氾濫を止めて貯水池を空にします。
滅菌済みの安全キャビネットの下で、500マイクロリットルのEC培地をリザーバーにピペットで入れ、200マイクロリットルのRPMIプラス培地で下部チャンバーを静かに洗い流します。その後、毎分21マイクロリットルの流量で灌流を再開します。12日目から14日目にかけて気液界面を確立するには、下部チャンバーのプラグを開き、気泡が見えるまで培地を慎重に吸収します。
チャネルとチャンバーからすべての液体が除去されたことを確認した後、ポートを慎重に閉じ、新たに調製した血管EC培地をリザーバーに充填し、14日目まで上部チャンバーでのみ増殖培養を続けます。バイオチップをフローシステムから外します。チューブを取り外した後、顕微鏡でバイオチップの細胞層を細胞の密度を調べます。
バイオチップの空洞をPBSで洗浄し、細胞培養培地を取り出します。PBS中の4%パラホルムアルデヒド溶液を300マイクロリットルを上部チャンバーに、200マイクロリットルを下部チャンバーに加えます。10分間のインキュベーション後、チャンバーをPBSで3回洗浄します。
透過化のために、PBS中の0.25%Triton X 100の300マイクロリットルを加え、30分間インキュベートし、PBSで洗浄した後、PBS中の300マイクロリットルの3%ウシ血清アルブミンを両チャンバー内でピペットで掴み、1時間インキュベートする。免疫蛍光染色には、適切な希釈比で各メンブレンに3%BSAを使用して50マイクロリットルの抗体溶液を調製します。バイオチップ内の細胞にアクセスするには、キャビティの外側を正確に切り込み、ボンディングホイルを取り外します。
メスを使用して、バイオチップに密封されたエッジを取り除き、メンブレンを切り取ります。メンブレンを2つに分割した後、メンブレンピースをピンセットで集め、顕微鏡のスライドに載せて染色し、各メンブレンピースに50マイクロリットルの抗体溶液を加え、光から保護するために摂氏4度で一晩インキュベートします。メンブレンをPBSで3回洗浄した後、ラベル付けされたスライド上に封入剤を一滴加え、対応するメンブレンを配置します。
メンブレンの上部に封入剤を一滴加え、カバーガラスを置きます。ヒト臍帯静脈内皮細胞の免疫蛍光染色により、14日間の共培養後に形態学的変化とマルコタンパク質の発現が明らかになりました。血管側では、内皮細胞境界でのVコヒーレント発現は、コンフルエンシーと内皮バリア形成を示唆していました。
上皮側は、エカヘリンとサーファクタントタンパク質Aの発現について評価され、肺胞上皮の完全性と機能を示しました。
