蛍光イメージングに最適な切断温度化合物での眼組織包埋および凍結切片

ウサギの眼の凍結保護が完了したら、30%ショ糖溶液から100ミリメートル解剖皿に移します。解剖顕微鏡で、目を慎重に裏返して、目の内側から余分なショ糖溶液を取り除きます。ワイプを使用して、目の外側の部分から余分なスクロース溶液をやさしく拭き取り、最適な切断温度またはOCT化合物を使い捨ての埋め込み型に0.5〜1センチメートルの深さまで充填します。

目を上向きの埋め込み型に置き、気泡の形成を避けて、目の内側をOCTコンパウンドでゆっくりと満たします。OCTコンパウンドに目が浮かび上がり、金型の内面に触れなくなったら、包埋型をパラフィンで包み、摂氏4度で一晩保管します。翌日、埋め込み型を解剖皿に入れます。

可能であれば、OCTコンパウンドを目の内側からワイプでそっと取り除きます。新しいOCTコンパウンドを充填した新しい埋め込み型に目を移します。次に、前と同じように金型を充填して、最終的な埋め込み媒体に破片や欠陥がないことを確認します。

向きを合わせるために、金型にラベルを付けます。クライオモールドで目を上向きに配置し、OCTコンパウンドが内側の網膜を裏打ちします。視神経乳頭を目印として使用して、目の上部を特定する ラベル付きの埋め込み型をドライアイスの上に置き、目が型の内面に触れたり、空気にさらされたりしないようにします。

ブロックをクライオスタットに取り付け、目の上部を上に向け、下部を下に向けて取り付けます。残りの角膜と虹彩が右または左を向いています。新しいブレードを目の垂直軸に平行に配置して、ブレードを分割します。

切片をカットして一晩乾燥させた後、スライドを80°Cの冷凍庫に入れます。ウサギの眼の全網膜凍結切片の蛍光画像は、上にある光受容体層からの有意な剥離なしに、均一な色素性網膜色素上皮層を示した。網膜切片の明視野画像は、すべての層の無傷の網膜形態をさらに示しています。