まず、サルモネラ菌に感染したマウス組織の解凍したサンプルをピンセットで拾います。液体アガロースが入ったプラスチック型の底にすばやく挿入します。重合が完了したら、メスを使用してプラスチック型の角から開きます。
ミクロトームにブレードを装着した後、手袋をはめた指でサンプルをサンプルボックスに移します。アガロースの上面がミクロトームのブレードと同じ高さになるように、サンプルをミクロトームの下に配置します。ステージを動かして、アガロースキューブを目標物の中心に配置します。
断層撮影ソフトウェアの[スライス]ボタンをクリックして、キューブの無傷のスライス全体が取得されるまで待ちます。次に、対物レンズを組織サンプルのx方向とy方向の中央に配置します。レーザーソフトウェアを起動し、波長を800ナノメートルに調整してから、レーザーをオンにします。
顕微鏡のキャビネットドアを閉じます。次に、部屋のすべての光源をオフにします。PMTをオンにし、電圧を750ボルトに設定します。
次に、顕微鏡のシャッターを自動に設定します。次に、V1とV2の電圧をそれぞれ20と1.71に設定します。ZピエゾデバイスでZ軸を組織表面に到達するまで調整します。
厚さ50マイクロメートルのスライスを複数カットします。次に、サンプルエッジを見つけるために、周囲のアガロースのイメージングを最小限に抑えて、イメージング領域を組織に閉じ込めます。PMTをオフにした後、レーザー波長を800ナノメートルに設定します。
レーザースポットを使用して、ステージをシフトしながら組織エッジの座標を見つけます。座標を確認したら、レーザースポットを右前方中央に配置します。次に、波長を940ナノメートルに変更します。
マイクロスコープのシャッターを自動モードに設定し、シャッター電圧をV1の場合は20、V2の場合は1.71に設定します。3D Mosaic設定オプションを押してスキャンを開始します。イメージング後、水タンクから組織切片を採取します。タイル画像をステッチするには、まず断層撮影サーバーからLinuxコンピューターにデータを転送します。
MATLAB スクリプト StepOneStitchingAndArchive を開きます。m に移動し、ソース フォルダーを見つけます。[エディター] タブに切り替えて、[実行] をクリックします。
進行状況の情報は、コマンド ウィンドウに表示されます。ソースフォルダ内のstitchedimages_100というサブフォルダでステッチされた画像を見つけます。tar コマンドを使用して生データを圧縮し、ファイル名拡張子 tar.bz2 の 1 つのファイルとして保存します。
サポート ベクター マシンをトレーニングするには、ステッチされた画像をプレビューします。フィジーの各サブフォルダから同じファイル名の画像を1つ開きます。3つのチャンネルを1つのカラー画像に統合し、バクテリアや組織の自家蛍光から明確な信号が見られるまで、各チャンネルの明るさを調整します。
各チャンネルの調整された最大強度レベルに注意してください。次に、MATLAB スクリプト StepTwoSegmentationAndAnalysis.m を開きます。トレーニングのソースフォルダと画像名を定義し、[エディタ]タブに移動して[実行]をクリックします。
色のしきい値を求めるダイアログボックスが表示されたら、フィジーでの以前の手動チェックに基づく値を入力します。ダイアログに従って、背景の領域と関心のある領域を選択します。モデルがどの程度適切にトレーニングされているかを示すグラフが表示され、さらに領域を追加する必要があるかどうかを尋ねられます。
細菌が明確にセグメント化できるようになるまで、関心領域と背景を追加します。セグメンテーション プロセスが自動的に実行され、進行状況はコマンド ウィンドウで確認できます。次に、コラーゲンの第2高調波信号を含む青チャンネルの画像を開きます。
最初のチャンネル画像をx軸とy軸の両方で10倍に曲げ、縮小した画像を新しいフォルダーに保存します。同じフォルダ内で縮小された画像を 3 回複製します。3Dビジュアライゼーションを行うには、アリーナビューでImarisビジュアライゼーションソフトウェアパッケージを起動します。
次に、IMSまたはTIFファイルを開きます。ディスプレイ調整ウィンドウで、さまざまなチャネルの色表現を調整します。[編集]メニューの[画像のプロパティ]をクリックして、最小値または最大値、およびガンマ補正の値を手動で設定します。
画像の外観を調整した後、スナップショットツールを使用して現在のビューをエクスポートします。ナビゲーション ポインターを使用してビューを検索し、プラス [追加] を使用してキー フレームを追加します。アニメーションアイコンを使用して、3D データをムービーとして表現します。
赤い録画ボタンを押してムービーを作成し、目的の宛先フォルダとファイルタイプに保存します。個々のサルモネラ細胞は、脾臓、肝臓、腸間膜リンパ節、パイエル板などのマウス臓器全体で検出されました。蛍光細菌のセグメンテーションは、免疫組織化学によって確認されました。
宿主細胞は、灌流前に表面マーカーに抗体を注入することにより、in vivoで染色しました。
