まず、ケラチノサイト無血清培地(KSFM)に浸漬した食道生検サンプルを採取します。KSFMを1ミリリットルのディスパーゼIと交換し、生検を室温で10分間インキュベートします。その後、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、生検や細胞破片ペレットに触れずにディスパーゼを吸引します。
次に、生検をDPBSですすいでください。生検を遠心分離した後、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して上清を吸引します。次に、500マイクロリットルのトリプシン-EDTAを生検に加え、800rpmで振とうしながら摂氏37度で10分間インキュベートします。
次に、単一細胞懸濁液が得られるまでピペッティングを繰り返します。ツベルクリン注射器のゴム製プランジャーヘッドを使用して、70マイクロメートルのセルストレーナーで細胞をろ過します。その後、ストレーナーを2〜4ミリリットルの大豆トリプシン阻害剤で洗います。
次に、5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブにスナップオンキャップが付いた35マイクロメートルのセルストレーナーで細胞をろ過します。細胞懸濁液を遠心分離した後、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して上清を吸引します。細胞ペレットを基底膜抽出ハイドロゲルマトリックスに再懸濁し、予め加温した懸濁細胞培養プレートに40マイクロリットルの液滴を形成します。
次に、培地なしでプレートを摂氏37度で20〜30分間インキュベートし、基底膜抽出液滴が固まるようにします。Y27632の10マイクロモルを添加した予熱したKSFMを追加します。9日目には、オルガノイドの中央に成長している角質化した芯にタマネギのような多層構造が観察されました。
