2光子顕微鏡を用いた新生児マウスの単一細胞レベル活性のイメージング

まず、顕微鏡下でのXY位置決めのために、チタンプレート付きの2軸ゴニオメーターをステージプレートに貼り付けます。スキャンソフトウェアをアクティブにし、20倍の対物レンズを使用してピクセルを512 x 512の双方向に設定します。頭蓋窓手術を行った後、GCaMPを発現する子犬を温熱パッドの半球の片側に置きます。

ネジを使用して、ヘッドマウントチタンバーをチタンプレートに固定します。次に、ゴニオメーターでウィンドウの角度を水平に調整します。バックライトで脳表面を照らし、5倍の対物レンズでXYポジショニングを使用してイメージングエリアを選択します。

20倍水浸レンズの下で、頭蓋窓に点眼薬を投与します。.バックライトを無効にした後、1つの光子モードで脳の表面をスキャンします。レーザー強度を上げて、ガラスと脳の表面からの緑色の自家蛍光を視覚化します。

外部光の干渉を防ぐために顕微鏡を覆います。スキャンソフトウェアを2光子モードで起動してイメージングします。次に、レーザー出力と検出器ゲインをキャリブレーションして、GCaMP信号を最適に視覚化します。

多くのGCaMP発現ニューロンが位置するイメージングエリアの深度を特定し、タイムラプスイメージングを開始してGCaMPシグナルを捕捉します。2光子顕微鏡法により、生後6日目の子犬のバレル皮質における第4層のニューロン活動が緑色蛍光で明らかになりました。緑色のGCaMPがより目立ち、その結果、赤色チャネルへの信号の漏れが発生し、14の関心領域が特定されました。