まず、分化したTHP-1細胞を入手し、培養プレートのウェルから使用済み培地を取り出します PBSで細胞を洗浄した後、リポ多糖(LPS)を含む無血清培地を細胞に加え、プレートをインキュベートします。次に、アデノシン三リン酸またはATPストック溶液をモデルグループに加え、プレートを摂氏37度で45分間インキュベートし、5%の二酸化炭素をインキュベートします。次に、培養プレートのウェルからすべての上清を吸引します。
PBSで細胞を2回洗浄した後、EDTAを含まない0.05%トリプシン500μリットルを各ウェルに加え、30秒間インキュベートします。細胞の剥離を止めるには、1ミリリットルのRPMI 1640培地を追加し、細胞を5ミリリットルのチューブに移します。チューブを300 Gで室温で3分間遠心分離します。
細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁した後、細胞の入ったチューブを摂氏37度の水浴に3分間入れ、遠心分離します。細胞を再懸濁するには、100マイクロリットルの1X結合バッファーを追加し、細胞を新しい5ミリリットルのチューブに移します。コントロールチューブとモデルチューブを適切な試薬と室温の暗所でインキュベートします。
インキュベーションを終了するには、チューブに400マイクロリットルのPBSを加え、それを穏やかにボルテックスします。細胞懸濁液を、5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに固定した35マイクロメートルのナイロンメッシュでろ過します。清潔なカバーガラスをクロムミョウバン溶液に2時間浸し、摂氏37度のオーブンで乾燥させます。
先に示したようにトリプシン処理した細胞をペレット化し、500マイクロリットルの電子顕微鏡固定液で室温で2時間固定した後、摂氏4度で一晩インキュベートします。固定溶液から細胞を採取した後、室温で300Gのペレット状にしてください。100マイクロリットルのPBSを追加し、細胞をやさしく吹き飛ばします。
細胞懸濁液をカバーガラスに落とし、5分間放置します。すべての上清を吸引し、細胞をPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。500マイクロリットルの1%オスミン酸固定液を追加します。
1時間後、すべての上清を吸引します。PBSを3回洗浄した後、エタノールの濃度を上げてサンプルを脱水します。臨界点乾燥機のスイッチを入れ、二酸化炭素タンクを開き、チャンバーを摂氏10度に冷却します。
サンプルを濾紙ですばやく包み、チャンバー圧力が1平方インチあたり0ポンドのときにチャンバーに入れます。温度が摂氏35度に安定し、圧力が1平方インチあたり1、250ポンドに達したら、毎分1平方インチあたり100ポンドで減圧します。チャンバー圧力がゼロのときにサンプルを取り出します。
最後に、導電性テープを使用して、スパッタコーダーを使用したアルミニウム製の試料ホルダーである走査型電子顕微鏡に試料を取り付けます。サンプルを2〜5ナノメートルの金の層で覆います。フローサイトメトリー解析では、LPS/ATP刺激後、QT領域の細胞が有意に増加し、細胞死を示すことが示されました。
原形質膜表面の走査型電子顕微鏡写真は、LPS/ATP刺激細胞の膜ブレブや破裂などのピロトーシスの特徴を示し、対照細胞は正常に見えました。また、LPS/ATP刺激により、細胞内に膜ブレブや細胞縮小などのアポトーシス特性が発現し、細胞の腫脹や膜破裂などのネクロプトーシス特性が認められました。
