まず、FPLCカラムをパックし、サンプルローディング用のサンプルループを準備します。次に、ソフトウェアに移動します。ポンプの設定をダブルクリックし、[手動負荷ループ]を選択します。
次に、カラムポートからのチューブをフローアダプター上部のチューブに接続します。ループEからチューブを緩め、廃棄物容器に入れます。次に、30ミリリットルのシリンジを使用してサンプルを引き上げ、シリンジを注入ポートアダプターに取り付けます。
シリンジを注入ポートにねじ込み、サンプルを注入して、サンプルループに目に見える形で注入されていることを確認します。次に、注入ポートをカラムキャップに差し込みます。サンプルループの下部からチューブをループEポートに接続します。
次に、ポンプBのチューブを溶出バッファーに入れます。[ホーム] タブに移動し、[新しいメソッド] を選択します。その後、左側の列にある[メソッド設定]タブを選択します。
[列タイプ]ドロップダウンメニューに移動し、[カスタム]を選択します。カラム容量を5ミリリットル、実行に必要な流量を1分あたり1ミリリットルとして入力します。ユニット選択にナビゲートし、メソッドの基本ユニットとしてCV、カラムボリュームを選択します。
インレット A がバッファ A1 に、インレット B がバッファ B1 に設定されていることを確認します。次に、左側のメニューにある[メソッドアウトライン]タブを選択します。[Equilibration] で、平衡化ボリュームを 10 CV に設定します。[Sample Application] タブで、サンプルループを観察してサンプルボリュームを設定します。[カラム洗浄]に移動し、洗浄量を 5 CV に設定します。溶出の場合は、グラジエント容量を 0%buffer B から 100%buffer B までの 14 CV に設定します。メソッドを保存して、分析を開始します。
フラクションコレクターが最初のフラクションの位置から始まることを確認します。実行名を入力し、[開始] をクリックします。サンプルの塗布中に、現在廃棄物容器に入っているチューブをきれいなビーカーに交換します。
これらのチューブから流れ出る未結合のタンパク質を流流として収集し、FTとラベル付けします。実行が完了したら、[ホーム] タブに移動し、[実行を開く] を選択します。ランを開いてクロマトグラムを表示します。トップメニューのPeak Integration(ピークインテグレーション)を選択して、取得したピークをマークします。
「フラクション」タブを選択して、溶出タンパク質を含むフラクションを視覚化します。
