TEMサンプル調製のための固定網膜オルガノイドの染色、脱水、浸潤

透過型電子顕微鏡用の固定網膜オルガノイド(RO)の染色を開始するには、固定後の固定中にピペットを使用して、マイクロ遠心チューブ内のオルガノイドに以前に添加されたオスミウム酸を除去します。次に、ROをpH 7.4の0.01モルPBSで各10分間3回洗浄し、続いて脱イオン水で各10分間3回洗浄します。最後に脱イオンした水洗浄液を取り外し、約150マイクロリットルの酢酸ウランと交換し、室温で1〜2時間染色します。

次に、ドラフトで酢酸ウランを取り除き、50%アセトンの1ミリリットルと交換して、サンプルを10分間脱水します。次に、70%80%90%と100%アセトンを2回連続して、それぞれ10分間、グラジエント脱水を行います。グラジエント脱水後、残留アセトンを廃棄し、アセトンとEpon-812樹脂の混合物を約150マイクロリットル追加します。.

チューブを摂氏37度のオーブンに1時間置きます。以前のアセトン-樹脂混合物を取り除いた後、アセトンとEpon-812樹脂混合物の異なる組成と交換します。今回は、チューブを摂氏37度で一晩インキュベートします。

最後に、網膜オルガノイドを約500マイクロリットルの純粋なエポキシ樹脂を含む新しいチューブに慎重に移します。そして、オルガノイド包埋を進める前に、摂氏45度で1時間インキュベートします。