まず、解剖顕微鏡、先端の細い鉗子2本、はさみ、1ミリリットルの注射針、濾紙を作業台に組み立てます。次に、肘ハサミを使用して、麻酔をかけたマウスから目を核形成します。0.1モルリン酸緩衝液に4%のパラホルムアルデヒドと0.2%のピクリン酸を含むガラス皿に目を入れます。
解剖顕微鏡では、1ミリリットルの注射器を使用して、角膜辺縁部に穴を開け、ハサミで前部を切り取ります。鉗子を使用して、網膜の内側の表面からレンズを取り外します。次に、2つの鉗子を使用して、網膜がアイカップから完全に分離されるまで、強膜を慎重に剥がします。
続いて、網膜を4つに切ります。一晩固定し、4%パラホルムアルデヒド溶液を0.01モルPBSで網膜組織を6回、それぞれ10分間洗浄します。網膜組織を1%水素化ホウ素ナトリウム中0.01モルPBSで30分間インキュベートします。
再度、網膜切片を0.01モルPBSで少なくとも6回洗浄します。次に、濾紙でガラス質を取り除きます。また、両刃のカミソリの刃を使用して、網膜を100〜300マイクロメートルの小さなセクションにスライスします。
網膜縞を0.01モルPBSでそれぞれ10分間6回洗浄してから、ABCキットの試薬Aおよび試薬Bと2日間インキュベートします。次に、網膜縞を0.05モルトリスバッファーでそれぞれ10分間3回洗浄します。ジアミノベンゼンまたはDABキットの5%試薬1および5%試薬3とレチナールストライプを蒸留水で室温で1時間事前にインキュベートします。
網膜縞をDABで染色するには、DABキットの3つのチューブから同量の溶液を順番に添加します。解剖顕微鏡で染色状態を観察します。網膜ストリップを0.05モルトリスバッファーでそれぞれ10分間3回洗浄します。
最後に、ストリップを0.01モルPBSでそれぞれ10分間6回洗浄します。対照実験では、2本のリボンを持つ円錐茎と1本のリボンを持つ球状の桿体は、一次抗体の非存在下で免疫反応性を示さなかった。プロテインキナーゼCαは、網膜の桿体双極細胞を同定しました。
DABスタンディングは、プロテインキナーゼCαおよび双極細胞樹状突起の存在を示し、外側のプレキシフォーム層にロッド末端とコーン末端を持つシナプスを形成します。さらに、DAB反応生成物は、桿体バイポーラ細胞末端と内側のプレキシフォーム層の軸索突起の同定に役立ちます。サブスタンスP免疫反応性アマクリン細胞は、サブスタンスP陰性アマクリン細胞に対してシナプス前であることが示されました。
さらに、サブスタンスP免疫反応性アマクリン細胞は、内側のプレジツ状層のサブレイヤー3およびサブレイヤー5レベルでそれぞれシナプス後からバイポーラ末端に存在していました。
