まず、70マイクロメートルのストレーナーを5ミリリットルのポリプロピレンチューブに置きます。その上に神経細胞培地の500マイクロリットルをピペットで移します。解離したマウス海馬組織ホモジネートをストレーナを介してチューブに移します。
次に、1ミリリットルの冷たい神経細胞培地をホモジナイザーに2回ピペットで入れてすすぎます。次に、500マイクロリットルの氷冷DPBSをペレットに追加して再懸濁します。DPBSでサスペンションの容量を1.5ミリリットルに補います。
サンプルに500マイクロリットルの等張パーコール溶液をピペットで入れます。遠心分離機で溶液を2ミリリットルの冷たくして溶液を重ねます。次に、最上層とミエリン椎間板を中間相で吸引します。
次に、4ミリリットルの冷たいDPBSをチューブに加え、遠心分離後に上清を吸引します。次に、細胞を100マイクロリットルの固定可能な生存率染色溶液に再懸濁します。1ミリリットルの冷たいDPBSをサンプルにピペットで注入してから、サンプルを300 x gで5分間遠心分離します。
上清を吸引した後、100マイクロリットルのCD16、CD32染色液を加えます。サンプルを5秒間ボルテックスしてからインキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルのFACSバッファーをサンプルに加え、遠心分離します。
染色マスターミックスの100マイクロリットルをチューブにピペットで移します。次に、暗所でサンプルを摂氏4度で30分間インキュベートします。次に、前と同じように遠心分離する前に、1ミリリットルのFACSバッファーをサンプルに加えます。
上清を廃棄した後、ペレットを250マイクロリットルの固定緩衝液に再懸濁します。次に、チューブに2ミリリットルの透過化バッファーを加え、再度遠心分離します。ペレットに100マイクロリットルのvGLUT1染色液をピペットで移します。
次に、インキュベーションと遠心分離の前に、混合物を約5秒間ボルテックスします。細胞ペレットを250マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。最後に、40マイクロメートルのフィルターでサンプルをろ過します。
海馬ミクログリアでは、アイソタイプコントロールと比較して、より高いvGLUT1-PE蛍光シグナルが観察されました。嗅球からのミクログリアでは海馬と比較して、より高いvGLUT1-PE蛍光シグナルが見られ、小脳では低いシグナルが見られました。最も低いシグナル強度は、脾臓マクロファージで検出されました。
