まず、解離したマウス海馬組織を含むチューブを、摂氏37度の水浴で20分間インキュベートします。曇った細胞懸濁液を新しい15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。上清を捨てた後、細胞ペレットを5ミリリットルの洗浄混合液に再懸濁します。
次に、サンプルを70マイクロメートルのフィルターに通して5ミリリットルの微量遠心チューブに入れてから、再び遠心分離します。サンプルをPercollグラジエント遠心分離にかけ、細胞ペレットを100マイクロリットルのMACS染色バッファーに再懸濁し、インキュベートします。次に、遠心分離する前に、1ミリリットルのMACSバッファーをサンプルにピペットで入れます。
次に、細胞ペレットを500マイクロリットルのMACSバッファーに懸濁します。次に、磁気セパレーターのポジセレクションカラムを3ミリリットルのMACSバッファーですすいでください。500マイクロリットルの細胞懸濁液をカラムに穏やかに塗布します。
MACSバッファーでカラムを3回洗浄した後、カラムを15ミリリットルのコニカルチューブに置きます。5ミリリットルのMACSバッファーをカラムに加えます。次に、サンプルを300gで10分間遠心分離し、1ミリリットルの予熱したDMEMをペレットに加えます。
最終細胞懸濁液500マイクロリットルを24ウェルプレートのウェルに移します。各ウェルの250マイクロリットルを、予熱した新鮮なDMEMと交換します。次に、3マイクログラムのpHrodo Red標識シナプトソームを培地に加えます。
同量の非標識シナプトソームをネガティブコントロールに加えます。インキュベーション後、冷たいDPBSでウェルを洗浄します。次に、200マイクロリットルのトリプシンEDTAを各ウェルにピペットで入れます。
35秒間のインキュベーション後、FBSを含むDPBSを1ミリリットルずつ各ウェルにピペットで入れます。細胞懸濁液をストレーナーを介して5ミリリットルのポリプロピレンチューブに移し、次に500マイクロリットルの氷冷DPBSで各ウェルを2回洗浄します。遠心分離機で500gで5分間サンプルを採取しました。
その後、細胞を100マイクロリットルの染色溶液に氷上で10分間インキュベートします。次に、染色液にCD11bとCD45を添加し、最終濃度を1〜100にします。暗所でサンプルを摂氏4度で20分間インキュベートします。
1ミリリットルのFACSバッファーをサンプルにピペットで注入し、フローサイトメトリー分析の前に300gで10分間の最終遠心分離にかけます。pH 4のシナプトソームから得られるものと同等の正のPE蛍光が、CD11b陽性およびCD45陽性のミクログリアで観察されました。
