トランスクリプトーム研究のためのマウスからの骨組織の単離と切片化

まず、マウスの皮膚に70%エタノールをスプレーします。次に、滅菌解剖ハサミを使用して、皮膚を開き、脚の筋肉を露出させます。脚に沿って筋肉を切って骨をはっきりと見ることができ、骨を傷つけずに優しく取り除きます。

すぐに骨を4%のパラアルデヒドを含むチューブに入れ、チューブを氷の上に置きます。すべての骨サンプルを採取した後、チューブを摂氏4度の冷たい部屋でオービタルシェーカーに最低24時間置きます。固定後、眼窩シェーカーから骨組織を取り出し、1X PBSで3分間ずつ2回洗浄します。

次に、滅菌解剖はさみを使用して、骨に付着している残りの筋肉を取り除きます。1X PBSで骨を再度3分間洗浄します。pH 8で20%DDTAを含む新しい容器に骨を入れ、140 RPMのオービタルシェーカーで室温で30分間インキュベートします。

次に、EDTA溶液を新しい20%DDTAと交換し、攪拌をさらに30分間繰り返します。最終的なEDTA処理後、新しいEDTAを加え、オービタルシェーカーで摂氏4度で容器を一晩インキュベートします。次に、EDTA容器からサンプルを取り出し、1X PBSで2回洗浄してEDTA残留物を除去します。

骨を70%エタノールに入れ、140RPMで15分間インキュベートすることにより、脱水プロセスを開始します。次に、70%エタノール溶液を捨て、90%エタノール溶液を追加します。140 RPMで15分間インキュベートします。

次に、脱水した骨組織をキシレンを入れた新しい容器に入れて、クリアリングプロセスを開始します。140 RPMで20分間インキュベートします。使用済みのキシレンを新しいキシレンと交換し、さらに20分間インキュベートします。

次に、透明化した骨サンプルを埋め込みカセットに入れ、ワックス浸潤を開始します。摂氏60度で30分間インキュベートします。使用済みのワックスを廃棄し、新しいワックスを加え、さらに30分間インキュベートします。

次に、ワックスを交換し、さらに45分間インキュベートします。骨を金型内の目的の方向に慎重に配置します。ワックスが冷たい表面で固まるのを待ちます。

ブロックをセクショニングまで摂氏4度で保管します。次に、切片化のための機器を準備します。すべての作業面と器具に除染液をスプレーして、RNaseを除去します。

また、摂氏42度の二重蒸留水でウォーターバスを設定します。ミクロトームブレードを70%エタノールで洗浄して油分を除去し、除染してRNaseを除去します。ブレードをミクロトームに固定し、クリアランス角度が10度に設定されていることを確認します。

ピンセット、ブラシ、プローブに除染液をスプレーし、1つのアイスバケツに保管します。別のアイスバケツに二重蒸留水を追加して、アイスバスを準備します。ミクロトーム上にFFPEブロックを配置して、切片化プロセスを開始します。

ミクロトームをトリミングするように設定するか、スクロールの厚さを14マイクロメートルに設定します。サンプルのトリミングを開始し、組織が見えるまで続けます。FFPEブロックを氷浴の上に置いて水分を補給します。

水和したサンプルをミクロトームサンプルクランプに固定し、ブレードに合わせ、スクロールの厚さを5マイクロメートルに設定します。組織の切片化を開始します。切片にした組織を冷たいピンセットとブラシで集め、摂氏42度の水浴に入れます。

スライドガラス上に組織を載せ、摂氏42度で3時間インキュベートします。スライドを室温のオーブンで一晩乾燥させます。準備したスライドは、スライドボックスに室温で保管します。

この方法を使用して、脱石灰FFPE骨サンプルをミラーリング大腿骨から調製しました。脱灰の時間経過は、未石灰化した大腿骨と3時間および24時間脱灰した大腿骨を比較することにより最適化されました。H染色とE染色では、脱灰時間が短いと切片の骨折や損傷につながることが示されましたが、24時間のプロセスでは優れた組織学的品質が得られました。

RNAフラグメント分布値DV200を用いたRNA品質評価により、脱灰したサンプルはDV200スコアを50%以上維持し、SCRNACや空間的トランスクリプトミクスなどの分析に適していることが明らかになりました。ただし、インキュベーション時間が長くなるとRNAの完全性が低下するため、推奨されません。