まず、臍帯血CD34+細胞を含むクライオバイアルを冷凍庫から取り出します。細胞を水浴で解凍してから、50ミリリットルのチューブに移します。チューブを滴下に振とうしながら、50%FBSと0.1ミリグラム/ミリグラムのDNaseを含む予熱したIMDMの細胞量の10倍をチューブに加えます。
細胞懸濁液を500 Gで5分間遠心分離します。ペニシリンとストレプトマイシンを含む20〜40マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁します。.使用するまで細胞を氷上に保管します。
27ゲージのハーフインチ針が付いた3ミリリットルの注射器を準備します。臍帯血CD34 +細胞懸濁液を含む29ゲージの12.7ミリメートル針を備えた0.5ミリリットルのインスリン注射器を準備します。次に、100マイクロリットルのブプレノルフィンが入った29ゲージの0.5インチ針で1ミリリットルのインスリン注射器を準備します。
麻酔をかけたマウスをノーズコーンに移し、つま先をつまんで注射の準備ができていることを確認します。マウスを仰向けに置き、後ろ足を曲げます。後ろ足を固定するには、利き手でない手の親指を足に、中指を腰に、人差し指を大腿骨の外側に置きます。
膝蓋骨の周りの髪をそっと抜き取り、アルコール綿棒でその部分を拭きます。次に、27ゲージのハーフインチ針が付いた3ミリリットルの注射器を使用して、大腿骨に向かって皮膚にそっと穴を開けます。針が骨に入ったら、針全体が骨に入るまで時計回りに回転させます。
反時計回りに回転させて、半分まで針を外します。アルコール綿棒で針の周りを拭き、針を反時計回りに回し続けて完全に取り外します。次に、細胞懸濁液を含む0.5ミリリットルのインスリン注射器を大腿骨軸に挿入します。
針が骨に入ったら、脚のグリップを放し、25マイクロリットルの懸濁液を大腿骨に静かに注入します。最後に、ブプレノルフィンを皮下に注射し、マウスを自宅のケージに戻して、麻酔から回復させます。
