まず、インキュベーターとペリスタルティックポンプのすべての領域を消毒剤で徹底的に洗浄し、準無菌環境を確保します。次に、各チューブを700マイクロリットルのPBSとマグネシウムとカルシウムで洗い流し、続いて500マイクロリットルのC2またはECコンディショニング培地を洗い流します。ルアーロックからペリスタルティックポンプストッパーまでの距離が短いチューブを左のキャビティに使用し、チューブをもう一方の対称にしたチューブを右のキャビティに使用します。
インキュベーターからHUVEC細胞とC2BBe1細胞を含むバイオチップを取り出した後、各チャンバーごとに350マイクロリットルの培地交換を行います。次に、プラグを下側から上側に移動します。バイオチップの下部チャンバーに350マイクロリットルの新鮮な培地を追加します。
その後、すべてのプラグを取り外し、すべてのポートを一番上まで埋めます。左側のキャビティから始めて、ルアーロックアダプターをバイオチップのポートに挿入して、最初のチューブを上部チャンバーの右側のポートに接続します。次に、2番目のチューブを下部チャンバーの左側のポートに接続します。
次に、リザーバーを取り、リザーバーの底に細胞培養培地を少量加えます。次に、リザーバーを最初のチューブの反対側に挿入し、もう一方のチャンバーについても繰り返します。すべてのポートをチューブまたはリザーバーに接続したら、リザーバーに3.5ミリリットルの細胞培養培地を入れます。
次に、蓋が取り付けられているチューブの緩い側をリザーバーの上部に配置して、各チャンバーのマイクロ流体システムを閉じます。バイオチップを蠕動ポンプに輸送します。蠕動ポンプストッパーを使用して、各チューブを蠕動ポンプに接続し、媒体がリザーバーからキャビティに流れ込み、ポンプを介して戻ってくるようにします。
次に、各チャンバーを毎分50マイクロリットルの流量で灌流します。事前増殖が完了したら、蠕動ポンプを停止します。各リザーバーのチューブに接続されている蓋を取り外し、ポンプの隣の滅菌ティッシュの上に置きます。
すべての培地を取り除いた後、リザーバーに2ミリリットルの新しく調製した培地を入れます。チューブと蓋を再接続し、毎分50マイクロリットルの流量でさらに24時間、円形の灌流を続けます。蠕動ポンプが停止したら、すべての空洞のリザーバーを開きます。
リザーバーを空にし、チューブとリザーバーをバイオチップから外します。マイクロ流体キャビティを500マイクロリットルの冷たいPBSでマグネシウムとカルシウムでチャンバーごとに2回洗浄します。500マイクロリットルの氷冷メタノールをすべての空洞に加えます。
チップを開いた後、バイオチップのボンディングホイルをカットまたは取り外します。PETメンブレンを含む組織を半分に切開し、異なる免疫パネルと並行して染色します。精密ピンセットを使用して、各メンブレン片をブロッキングおよび透過化溶液を含む24ウェルプレート内の別々のウェルに移します。
次に、メンブレン片を湿ったチャンバー内のきれいなスライドガラスに移します。調製した一次抗体と染色液50 μLを各メンブレンピースに加えます。サンプルを24ウェルプレートに移した後、メンブレンを洗浄液で5分間2回洗浄し、次にマグネシウムとカルシウムを含むPBSで洗浄します。
蛍光封入剤とカバーガラスを使用して、膜片を清潔なスライドガラスに取り付け、顕微鏡イメージングまで摂氏4度で保存します。5日間の増殖後、DAPIで染色した核DNAは、CD68を発現する完全に分化した単球由来マクロファージが血管組織全体に広がっていることを示しました。HUVECは、VE-カドヘリンなどの接着接合部の形成により、組織の完全性を示すコンフルエント層を作製しました。
さらに、フォン・ヴィレブランド因子はHUVECによって高度に表現されます。5日間の増殖後、C2BBe1細胞は、結合タンパク質E-カドヘリンとZO-1を発現する分極した上皮細胞層を形成しました。上皮の絨毛状および陰窩状構造の三次元成長は、6日間の灌流後にZスタックのxおよびyセクションで検出できます。
