マウスにおけるLCMV特異的濾胞性ヘルパーT細胞の初期発生のマッピング

まず、6〜8週齢のCD 45.1陽性SMARTAマウスを採取し、100マイクロリットルのRPMI培地に200マイクログラムのLCMV GP 61-77ペプチドを静脈内注射します。マウスから脾細胞を取得した後、それらを2%RPMIで懸濁して、eighT細胞の10倍/ミリリットルの細胞密度を達成し、細胞の入ったチューブを氷上に置きます。50マイクロリットルの細胞懸濁液と150マイクロリットルの染色バッファーを丸底の96ウェルプレートの各ウェルに分注します。

96ウェルプレートを800 Gで摂氏4度で1分間遠心分離し、上清を慎重にデカントします。プレートをボルテックスし、各ウェルに200マイクロリットルの染色バッファーを追加します。細胞をペレット化した後、細胞を再懸濁し、表面抗体カクテルとともに氷上で30分間暗所でインキュベートします。

2回洗浄した後、細胞を200マイクロリットルの染色バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに移します。フローサイトメトリー解析を行い、SMARTA CD4陽性T細胞の活性化状態を確認します。次に、ウェルあたり6個のSMARTA CD4陽性T細胞を10個、24ウェルプレートに1回播種します。

細胞を800Gで摂氏4度で3分間スピンダウンし、上清培地を慎重に取り除きます。次に、1ミリリットルのレトロウイルス培地と8マイクログラムのポリブレンを各ウェルに加えます。細胞を800Gで2時間、摂氏37度でスピン形質導入します。

レトロウイルス培地を廃棄した後、インターロイキン2を添加した予熱した10%RPMI1ミリリットルで細胞をインキュベートします。細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離します。上清を捨てた後、細胞を2%RPMIで再懸濁して、10の10の1倍から1ミリリットルあたり8番目の細胞の細胞密度を達成します。

形質導入効率を評価するために、50マイクロリットルの細胞懸濁液を丸底の96ウェルプレートに分注します。CD4、Vα two、ベクタータグ関連抗体などの表面抗体カクテルと氷上でインキュベートします。細胞を洗浄し、前に示したようにフローサイトメトリーを実行します。

次に、6つのCD 45.1陽性SMARTA CD4陽性T細胞のうち10個をC57BL / 6レシピエントマウスに静脈内注射し、続いて翌日LCMVアームストロングの6つのプラーク形成ユニットに1回10を注入します。マウスから脾細胞を取得した後、それらを染色して目的のマーカーを確認します。転写因子を検出するには、細胞を200マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドと室温で暗所で20分間インキュベートします。

最後に、フローサイトメトリーを実施して、初期の急性LCMV感染段階で因子を検出します。感染後3日目には、MIGR1 SMARTA CD4陽性T細胞のうち、濾胞ヘルパーT細胞とTヘルパー1細胞のバランスの取れた分岐が見られた。MIGR1、BCL6、SMARTA、CD4陽性T細胞では、主な濾胞性ヘルパーT細胞による分化とBCL6発現レベルの増強が観察されました。