蛍光活性化細胞選別と線維脂肪原性前駆細胞(FAP)の培養

まず、単色およびFMOコントロール用に、2倍の使用濃度で30マイクロリットルの染色バッファーを調製します。単色染色バッファーとFMOコントロール染色バッファーを96ウェルプレートのウェルに移します。20マイクロリットルのFACSバッファーをボリュームに補充します。

サンプルを染色するには、1.5 mL の遠心分離チューブに 0.5 mL の 2x FACS 染色バッファーを調製します。細胞懸濁液の10マイクロリットルを単色およびFMO制御井戸にピペットで固定します。次に、2x FACS染色バッファーを残りの細胞懸濁液に加え、インキュベートします。

次に、100マイクロリットルのFACSバッファーをウェルに加え、2ミリリットルのバッファーをサンプルチューブに加えます。500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを生存率緩衝液に再懸濁します。

300マイクロリットルの増殖培地を1.5ミリリットルの遠心分離チューブに加えます。これらは、細胞選別のためのコレクションチューブとして機能します。FACSを用いて細胞を選別した後、採取した細胞を800Gで4°Cで10分間遠心分離します。

P1000ピペットを使用して、ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除きます。ペレットを増殖培地に再懸濁し、最終密度が100細胞/マイクロリットルになるようにします。細胞懸濁液を48ウェル組織培養プレートのウェルに播種します。

最後に、プレートを摂氏37度のインキュベーターに移し、細胞がコンフルエントになるまで、それぞれのガス補給を行います。典型的な線維芽細胞の形態を持つコンフルエント細胞は、培養後5日以内に得られました。