ライブイメージングを用いた放射線感受性評価のための患者由来腫瘍オルガノイドの照射と処理

まず、患者由来の腫瘍オルガノイドまたはPDTOを入手し、3〜4日ごとに3ミリリットルの新鮮で濃縮されたDMEM F/12培地をPDTOに加えます。小動物研究用放射線プラットフォーム照射器を用いて、PDTO含有ドームをオープンフィールドモードで照射します。照射後すぐに、ナグリゲルドームを含む各PDTOを2ミリリットルの濃縮DMEM F / 12培地で洗浄します。

次に、P1000を使用して、市販の組換え酵素の1〜3ミリリットルにPDTOを再懸濁します。細胞懸濁液を50ミリリットルの遠心チューブに移し、摂氏37度で5分間インキュベートします。チューブを遠心分離して細胞をペレット化し、上清を吸引してチューブ内に約1ミリリットルの組換え酵素を残します。

次に、濃縮DMEM F/12培地で細胞を洗浄し、細胞懸濁液を40μmメッシュフィルターでろ過して細胞クラスターを除去し、ろ過した細胞の小さなサンプルをPBS中の10%トリピンブルーで染色し、自動セルカウンターでカウントします。細胞を再懸濁して、66%マグリゲルを含む50マイクロリットルの濃縮培地中に800個の細胞の密度を達成します。次のプレートは、イメージング適合48ウェル培養プレートの別々のウェルに各ドームをインキュベートし、プレートをインキュベートしてマグリゲルを固化させる。

最後に、0.5〜1ミリリットルの濃縮DMEM F/12培地を各ウェルに加えて、ライブイメージングを行います。