10%FBSを添加したDMEMを添加した6ウェルプレートで1ウェルあたり10〜5番目のDF-1細胞を5回培養する。細胞が80%のコンフルエンスに達したら、細胞培養培地を含む血清を廃棄します。PBSで細胞を3回洗浄した後、2ミリリットルの無血清細胞培養培地を加え、続いてIBDVウイルス溶液を各ウェルに加えます。
ウイルス吸収の1時間後、PBSで細胞を3回洗浄し、2%FBSを添加した2ミリリットルのDMEMで24時間インキュベートします。ウェルあたり500マイクロリットルのトリプシンを加え、続いて1分後に10%FBSを含む2ミリリットルのDMEMを加えます。細胞を遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。
細胞ペレットをPBSに再懸濁した後、チューブを3秒間穏やかにボルテックスし、前述のように細胞を遠心分離します。顕微鏡下で血球計算盤を使用して細胞をカウントし、細胞を適切な量のフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁し、懸濁液をボルテックスします。100マイクロリットルの単一細胞懸濁液を5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブに加えます。
IBDV感染細胞をインキュベートし、模擬対照細胞を1マイクログラムの適切な抗体で氷上で暗所で30分間インキュベートします。10分ごとにチューブを静かにボルテックスします。1ミリリットルのフローサイトメトリー染色バッファーで細胞を洗浄し、チューブを遠心分離します。
上清を廃棄した後、ペレットを100マイクロリットルのフローサイトメトリー染色緩衝液に再懸濁します。次に、暗所で室温で10分間、ヨウ化プロピジウム1ミリリットルあたり10マイクログラムで細胞をインキュベートします。さらに、フローサイトメトリーアッセイ用に400マイクロリットルのフローサイトメトリー染色バッファーを添加します。
ブランクコントロールチューブとそれに続く単一の染色チューブでフローサイトメトリーを行い、すべてのサンプルを実行する前に電圧と補償パラメータを調整します。フローサイトメトリーでは、IBV感染後にかなりの数の細胞がニワトリGasdermin EのN末端断片に陽性であったのに対し、切断されたニワトリGasdermin EのC末端断片は、膜表面抗原染色を用いたフローサイトメトリーではほとんど検出できなかったことが示されました。IBDV感染細胞におけるニワトリガスデルミンEおよびヨウ化プロピジウム二重陽性細胞のN末端断片の集団は、模擬感染対照群のそれよりも有意に多く、IBDV感染細胞のこの部分がピロトーシスを受けていたことを示唆している。
