まず、オルガノイド由来の2D単層培養用の細胞培養インサートに細胞外マトリックスをコーティングします。調製した各細胞培養インサートの頂端チャンバーに100マイクロリットルの細胞外マトリックスコーティングを塗布し、蓋を元に戻します。次に、細胞培養プレートを加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。
直腸オルガノイド細胞の場合、インキュベーション後、細胞外マトリックスコーティングを直腸単層培養培地に交換し、一晩インキュベートします。オルガノイドの酵素消化と単一細胞への濾過後、細胞懸濁液を200 gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。次に、単層培養培地中の細胞培養インサートあたり200マイクロリットルの細胞懸濁液を調製します。
細胞外マトリックスコーティングされた細胞培養インサートを含む24ウェル細胞培養プレートを取り出します。真空吸引を使用して、コーティングが乱れないように、各細胞培養インサートのアピカルチャンバーを慎重に空にします。200マイクロリットルの単一細胞懸濁液を各細胞培養インサートの頂端チャンバーに慎重に塗布します。
適切に補充した単層培養培地500マイクロリットルを各ウェルの基底側チャンバーに加えます。次に、加湿インキュベーターでプレートをインキュベートして細胞の接着と増殖を促進し、細胞培養インサート上にコンフルエントな2D単分子膜を形成します。細胞播種から48時間後から、頂端室と基底外側室の両方で培養培地を隔日で交換します。
オルガノイド由来の2D単分子膜の免疫蛍光染色は、メスブレードで細胞培養インサート膜を慎重に切り取り、細胞培養インサートをスライドガラスの上に置きます。カバースリップに封入剤を添加し、スライドガラスの上に置いてから細胞を観察します。解離した成熟オルガノイドを細胞培養インサートに播種した翌日、2D単分子膜が形成されたように見えました。
走査型電子顕微鏡は、播種から5日後に2D単分子膜の頂端表面によく発達した微絨毛と細胞境界を明らかにしました。2D単分子膜の免疫蛍光染色により、回腸オルガノイドおよび直腸オルガノイド由来の2D単分子膜の両方に、頂端ブラシ境界、基底外側接着接合部、および粘液産生杯細胞の存在が確認されました。
