パラセル透過性アッセイを用いたオルガノイド由来2D単分子膜の上皮バリア完全性の評価

まず、オルガノイド由来の2D単分子膜を持つ細胞培養インサートを含むプレートをインキュベーターから取り出します。評価する細胞培養インサートの頂端室と基底外側室の両方から単層培養培地を取り出します。頂端室と基底室を200マイクロリットルと500マイクロリットルの予熱PBSで2回優しく洗浄します。

アピカルチャンバーから洗浄液を取り出し、PBS中の0.5ミリグラム/ミリリットル4キロトンのFITC-デキストラントレーサーを200マイクロリットルを細胞培養インサートのアピカルチャンバーに塗布します。プレートを加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で20分間インキュベートします。次に、インキュベートした24ウェルプレートの基底側チャンバーから50マイクロリットルをサンプリングし、マイクロプレートリーダーと互換性のある96ウェルプレートに移します。

サンプリングしたウェルの基底外側チャンバー内の50マイクロリットルの新鮮なPBSを交換します。事前にキャリブレーションされたマイクロプレートリーダーを使用して、励起波長495ナノメートルと発光波長535ナノメートルの蛍光強度を直ちに測定します。