ヒト乳腺上皮細胞を単離するための乳腺組織の消化

まず、組織を解離します。2対の鉗子を使用して、乳房組織から脂肪組織を取り除きます。残りの乳腺組織の重量が約1グラムであることを確認してください。

乳房組織を5ミリリットルの75%エタノール溶液で5秒間すすぎます。その後、20ミリリットルの洗浄液で5分ずつ2回ずつ洗浄します。次に、2つの外科用ブレードを使用して、乳房組織を小さな断片にスライスします。

組織ホモジネートを得るために15分間連続して、細断した組織を50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。10ミリリットルのディスパーゼとコラゲナーゼ溶液、3ミリリットルの0.25%トリプシン、7ミリリットルのPBSを加えて、合計20ミリリットルの消化液を加えます。チューブを摂氏37度の水浴に入れ、20分ごとにチューブを振とうしながら1時間半インキュベートします。

消化プロセスを停止するには、20ミリリットルの中和液を追加します。次に、内容物を約15回ピペットで動かして、完全に混合します。混合物を100ミクロンメッシュフィルターでろ過します。

その後、156Gで5分間遠心分離します。次に、上清を取り除きます。ペレットを20ミリリットルの中和溶液でインキュベートを繰り返し、ピペッティングで混合します。

再度5分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを10ミリリットルの初期培養培地で再懸濁します。細胞懸濁液を100mmの細胞培養皿にプレートします。

5%二酸化炭素インキュベーターで細胞を摂氏37度で培養します。元の培地を3日ごとに新鮮な上皮細胞培地と交換します。細胞をチェックし、2日ごとに培地をリフレッシュします。

このプロトコルを使用して、ヒト乳腺上皮細胞を乳腺組織から単離した。単離後の分析では、ROCK阻害剤Y-27632で処理した細胞は、対照群と比較して顕著な増殖を示したことが示されました。CCK-8アッセイにより、Y-27632を含有する培地中の細胞は、対照培地中の細胞よりも有意に高い速度で増殖することが明らかになりました。

免疫蛍光アッセイにより、大多数の細胞が乳腺上皮細胞マーカーであるCK7およびGATA3を発現し、その後の継代における他の細胞タイプの存在は無視できることが確認されました。さらに、qRT-PCR研究では、CK7およびGATA3の発現レベルが数継代にわたって一貫していることが示され、一貫した表現型または分化能力が示されました。