DHEを用いた単一血小板蛍光イメージングによるスーパーオキシド陰イオンの検出

まず、改質チロード緩衝液に適切なコーティング溶液を調製し、8ウェルマイクロスライドを摂氏37度で2時間インキュベートしてコーティングします。次に、コーティングされたマイクロスライドを改変されたタイロードバッファーで2回洗浄します。マイクロスライドを、1ミリグラム/ミリグラムのBSAを含む改変型タイロード緩衝液で少なくとも30分間インキュベートし、非特異的接着をクエンチします。

洗浄した血小板を調製するには、クエン酸抗凝固全血を200 Gで20分間遠心分離して、多血小板血漿を取得します。次に、インドメタシンとPGE1を多血小板血漿に加え、500Gで10分間遠心分離します。得られた血小板ペレットを改変型TyrodeのHEPES緩衝液に摂氏37度で再懸濁し、10の4倍10の密度を1ミリリットルあたり7血小板の累乗にします。

分離された血小板を摂氏37度で30分間休ませます。.次に、血小板懸濁液にDHE溶液を添加して最終濃度を10マイクロモルにし、摂氏37度で1分間インキュベートします。インキュベーション後、ブロッキング溶液をマイクロスライドから取り出し、顕微鏡ステージ上に置いてイメージングします。

次に、血小板を静かに分注します。倒立共焦点顕微鏡で40倍油浸レンズを使用して、DHEから2-ヒドロキシエチジウムへの変換を監視します。10 分間の画像、10 秒ごとに画像を収集します。

アゴニストに応答したスーパーオキシドアニオンの生成をモニタリングするには、血小板を分注してから10分後に可溶性アゴニストを添加し、さらに10分間蛍光画像を採取します。このプロトコルを使用して、血小板がコラーゲンまたはフィブリノーゲンに接着する間、およびトロンビンで刺激されたPLLに付着した血小板からのスーパーオキシドラジカルの生成を研究しました。