電子常磁性共鳴を用いた血小板中のスーパーオキシドアニオンの検出

まず、クエン酸抗凝固全血を200gで20分間遠心分離することにより、多血小板血漿を取得します。インドメタシンとPGE1を血漿に加え、500gで10分間遠心分離します。得られた血小板ペレットを改変型TyrodeのHEPES緩衝液に摂氏37度で再懸濁し、1ミリリットルあたり2x10^8の血小板の密度を得る。

血小板を摂氏37度で30分間休ませます。DETCを最終濃度5マイクロモルに、デフェロキサミンを最終濃度25マイクロモルに血小板懸濁液に加え、続いてCMHを最終濃度200マイクロモルに添加します。テフロンコーティングされた攪拌磁石を備えた凝集キュベットにサンプルを入れ、アグリゴメーターにロードします。

1分後、トロンビンやコラーゲンなどの刺激を加え、10分間インキュベートします。インキュベーション後、血小板懸濁液を凝集キュベットからマイクロ遠心分離チューブに移し、6, 000gで10秒間迅速にスピンダウンします。上清50マイクロリットルをキャピラリーマイクロピペットにロードし、ESRシーリングワックスで密封します。

サンプルをESRスキャナーに転送し、スキャナーでパラメーターを設定します。CMH の CM ラジカルへの酸化を、記録された ESR ピークの曲線下面積として推定します。市販のCMラジカルを使用して検量線を取得します。

サンプル中のESR信号強度は、ESRピークの強度に比例していました。検出の特異性は、ROSスカベンジャーおよびスーパーオキシドアニオンを生成する酵素の選択的阻害剤で確認されました。選択的阻害剤の存在下でのトロンビンまたはコラーゲンによる血小板刺激のデータはVAS2870 NADPHオキシダーゼが、これらのアゴニストの両方に応答する血小板スーパーオキシドアニオンの主な供給源であることが示唆されました。