ヒト疾患におけるミクログリア動態を調べるための全血由来単球からの誘導ミクログリア様細胞の取得

まず、全血からヒト単核細胞を入手します。Vortex Human FcR ブロッキング試薬を添加し、必要な量の試薬を細胞に添加します。チューブを細胞と4°Cで5分間インキュベートします。

10個あたり20マイクロリットルのCD11b MicroBeadsを合計7個の細胞の累乗に添加し、摂氏4度で20分間インキュベートします。マグネティックスタンドを70%エタノールで十分に消毒します。インキュベーション後、10ミリリットルのアイソレーションバッファーを添加します。

混合し、チューブを300Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。スタンドが乾いたら、磁気カラムを磁気スタンドに置きます。上清を取り除いた後、1ミリリットルのアイソレーションバッファーを加え、ピペットで穏やかに混合します。

次に、細胞懸濁液をカラムにロードし、カラムリザーバーが空になるたびに3ミリリットルの分離バッファーで3回洗浄します。カラムを磁気部分に触れないように15ミリリットルの円錐管に入れます。5ミリリットルのアイソレーションバッファーを追加した後、プランジャーをチューブに押し込み、液体をカラムから押し出します。

チューブに回収した細胞懸濁液を遠心分離します。上清を吸引し、細胞を分離培地に再懸濁します。細胞計数後、500マイクロリットルの細胞懸濁液を24ウェルプレートの各ウェルに分注し、一晩インキュベートします。

ミクログリア様細胞を誘導するには、前日の播種から分離した培地を誘導培地に交換し、細胞を14日間インキュベートします。誘導されたミクログリア様細胞は、微細な体細胞体と多数の分岐した側副体を示しました。