ゼブラフィッシュ卵巣からの無細胞顆粒膜無細胞期I卵子の単離

まず、ゼブラフィッシュの切除した卵巣を、2ミリリットルの細胞解離溶液が入った6ウェルプレートに移します。卵巣を摂氏28.5度で2〜3時間インキュベートします。あらかじめ温めたL15培地を2〜3ミリリットルをバッファーに加え、消化を止めます。

次に、70 μmのセルストレーナーを6ウェルプレートの別のウェルに入れます。L15ミディアムをウェルに追加し、ミディアムレベルがストレーナよりも高いことを確認します。次に、ピペットを使用して、細胞ストレーナーを通して消化培地を引き出します。

ピペットで余分な培地を取り除きます。4ミリリットルの新鮮なL15培地をウェルに加え、卵母細胞を穏やかに再懸濁します。数分後、上清をピペットで排出します。

品質管理のために卵子を選択するには、新鮮なL15培地を含む幅35mmの皿に卵子を移します。10倍以上の倍率で光学顕微鏡で卵子を観察します。鈍い注入ツールを使用して、細胞断片、ステージ1の卵子、またはその他のステージの卵子を取り出します。

成長段階を確認するために、卵子を含むL15培地にHoechst 33342を添加し、インキュベートします。紫外線レーザー励起下で蛍光顕微鏡で卵子を観察します。針で目的の基準を満たさない卵母細胞を慎重に選びます。

若年卵巣は、ステージ2の卵子の小さな集団を伴う透明なステージ1の卵子を豊富に示しました。成魚の卵巣は、不透明な後期期2〜3個の卵子が優勢であることを示しました。参照法により、卵子の表面に多数の染色された顆粒膜細胞核が卵子を密に包み込みました。

対照的に、改良された方法では、顆粒膜細胞の核染色を欠いたステージ1の卵子の分離が可能になりました。