アカゲザルの膵島細胞分画によるシングルセルRNAシーケンシングおよびメタボロミクス

まず、分離されたアカゲザルの膵島組織を氷上で解凍します。500マイクロリットルの0.1X溶解バッファーを組織ペレットに加えます。使い捨てのRNaseフリーペレット乳棒を使用して、氷上で組織を15回穏やかに均質化します。

サンプルを氷上で10分間インキュベートします。次に、ホモジネートに500マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、氷の上でピペットで穏やかに混合します。300 μmのプレセパレーションフィルターに300 mmリットルの洗浄バッファーを充填し、1 mリットルの細胞ホモジネートを 5 mL のチューブにろ過します。

ろ過したホモジネートを500gで5分間、摂氏4度のスイングバケット遠心分離機で回転させます。ピペットを使用して、上清の1ミリリットルを氷上のクライオバイアルに移し、将来のメタボロミクス実験のためにすぐに摂氏マイナス80度で凍結します。1ミリリットルの洗浄バッファーを核ペレットに滴下して再懸濁します。

洗浄したペレットを1, 000gで5分間回転させ、摂氏4度のスイングバケット遠心分離機で回転させます。洗浄を繰り返した後、核を1ミリリットルの洗浄緩衝液に再懸濁します。ピペットを使用して、核懸濁液と0.4%トリパンブルーをそれぞれ10マイクロリットルずつ別のチューブで混合し、その混合物を自動セルカウンタースライドに加えます。

最後に、セルカウンターを使用して、核の濃度を決定します。シーケンシング実験のために、理想的な無傷の核が得られました。遺伝子発現研究に基づいて、単離された胎児、非ヒト、霊長類の島内の細胞サブタイプのUMAPクラスタリングが得られました。

ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール3-リン酸、2-オキソグルタル酸、クレアチン、およびグルタチオンなどの膵島代謝物の存在量は、細胞質画分を用いて得られた。