96ウェルプレートで内皮細胞を増殖させた後、インキュベーターから取り出し、倒立顕微鏡を使用して密度を確認します。プレートをシンクにフリックしてメディア全体を取り出し、プレートの上部をペーパータオルで拭き取ります。HBSS HEPESアッセイバッファーとプロベネシド溶液を50ミリリットルのマルチチャンネルピペットソルベントリザーバーに加えます。
マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに100マイクロリットルのアッセイバッファーを加え、細胞を5分間放置します。次に、プレートをフリックしてアッセイバッファーを取り出します。ダウンロードバッファーを別の50ミリリットルマルチチャンネルピペットソルベントリザーバーに追加します。
マルチチャンネルピペットを使用して、アッセイプレートの各ウェルに50マイクロリットルの色素ローディングバッファーを加えます。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で45分間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを蛍光顕微鏡で観察し、色素の取り込みを確認します。
プレートをフリックして染料溶液を取り除きます。各ウェルで50マイクロリットルのHBSS HEPESアッセイバッファーとプロベネシド溶液で細胞を2回洗浄します。プレートをフリックして、アッセイバッファーを取り出します。
各ウェルに92マイクロリットルのHBSS HEPESアッセイバッファーを添加し、再度、蛍光顕微鏡で細胞を観察して、余分な色素が完全に除去され、細胞が接着したままであることを確認します。マルチチャンネルピペットを使用して、2マイクロリットルのアンタゴニスト溶液とビヒクルを適切なウェルに加えます。プレートリーダーの電源を入れた後、温度を摂氏37度に設定し、プレートを15分間インキュベートします。
カラム 1 と 2 でバックグラウンド蛍光を測定し、ウェルごとに 5 回のスキャンを行います。プレートリーダーからプレートを取り出し、次に8チューブPCRストリップから、マルチチャンネルピペットを使用して6マイクロリットルのアゴニスト溶液をカラム1と2の各ウェルにすばやく加えます。細胞内でカルシウムの動員が起こるときの蛍光の変化を測定します。
各ウェルのスキャンを20回実行します。内皮細胞を用いたカルシウム動員アッセイでは、アンタゴニストを含まないポジティブコントロールウェルが蛍光の急速な増加を示すことが示されました。アンタゴニスト濃度が高いウェルは、アゴニストを含まないネガティブコントロールウェルと同様に、蛍光の変化が最小限でした。
