まず、マウス海馬スライスの共焦点画像を取得します。Neurolucida 360ソフトウェアで画像ファイルを開いた後、3D環境ウィンドウの上部ツールバーにある移動/ピボットポイントツールを左クリックします。次に、目的の樹状突起を左クリックして、新しいピボットポイントを確立します。
その後、向きのリセットアイコンを左クリックして、元のビューを復元します。次に、移動/ピボットポイントツールを再度クリックして、樹状突起のトレースを続けます。3D環境ウィンドウ内のツリータブを左クリックします。
トレース・モードと指向性カーネルについては、「ユーザー・ガイド」トレース・オプションの方法として、「ユーザー・ガイド」を選択します。樹状突起のトレースを開始するには、円形のカーネルが表示されたらすぐに樹状突起を左クリックします。次に、樹状突起セグメントに沿ってカーソルを移動します。
カーネルの継続的な装着を確保するには、カーソルを樹状突起上でゆっくりと前後に動かします。次に、左クリックして、検出されたカーネルを保護します。カーネルが入力を停止した場合は、カーネルが樹状突起に沿ってさらに表示されている場所を左クリックして手動で配置し、右クリックしてトレースを停止します。
3D 環境ウィンドウ内を左クリックしてドラッグし、ピッチ、ヨー、ロールの 3 次元すべてで樹枝状トレースの精度を確認します。樹状突起トレーシングが目的の経路から逸脱している点を特定します。樹状突起トレースの不正確さを修正するには、ツリーメニュー内にある編集タブに移動します。
対象の樹状突起を左クリックし、次にポイントをクリックして必要な調整を行います。次に、不適切に配置された点をクリックしてドラッグして、樹状突起セグメントに戻します。無関係なポイントを左クリックして削除し、削除ボタンをクリックします。
ポイントが樹状突起セグメントを適切に覆っていない場合は、ポイントを左クリックし、スライダーを使用して厚さを変更してサイズを調整します。その後、3D環境ウィンドウ内の[背骨]タブに移動します。外部範囲、最小高さ、最小ボクセル数の検出設定を行います。
検出器の感度を70%に調整し、[すべて検出]を左クリックして、設定された感度レベルに従ってすべての樹状突起のスパインを特定します。樹状突起固有の選択については、Click Image」オプションを使用して最も近い枝のすべてを検出し、各樹状突起を手動で左クリックして異なる検出器感度を適用します。棘を検出したら、樹状突起をクリックして3方向すべてにドラッグし、カバレッジを調べます。
検出されたスパインが不足している場合は、検出器の感度を5%から10%増やし、もう一度[すべて検出]をクリックして、より高い感度レベルに交換します。スパインがいっぱいになっていることが検出された場合は、検出器の感度を5%から10%下げ、もう一度「すべて検出」を選択して、スパインの検出を低い感度で更新します。次に、3D環境のスパインタブにある「既存のスパインを保持」を左クリックします。
「画像をクリックして最も近いブランチのすべてを検出する」オプションが有効になっている場合は、必ず選択を解除してください。特定の樹状突起に焦点を合わせてさらに脊椎を分析するには、[ピボットポイントの移動]を左クリックし、目的の樹状突起をクリックしてピボットポイントを設定します。ピボットポイントを設定したら、「ピボットポイントを移動」の選択を解除します「未塗りのように見える樹状突起スパインを特定します。
検出器の感度を前の設定より10%から20%増やし、背骨を直接左クリックします。スパインが入力されない場合は、「選択した場所でスパインを検出できません」というメッセージが表示されます。検出器の感度を段階的に上げ、スパインが検出されて適切に充填されるまで、100%を超える可能性があります。
不足している背骨を修正するには、編集タブに移動して左クリックします。[削除]を選択し、編集タブの選択を解除します。感度を5%から10%上げ、背骨を再度左クリックします。
脊椎がいっぱいになっている場合は、編集タブに移動して選択します。[削除]をクリックし、編集タブの選択を解除します。感度を5%から10%下げて、背骨を左クリックします。
樹状突起を検査して、隣接する樹状突起に属する可能性のある棘、誤検知、または棘として誤って識別された樹状突起セグメントがないか調べます。「削除」を利用して、これらの不正確さを削除します。次に、樹状突起で識別された棘にアクセスします。
複数のスパインが 1 つのコングロマリットにマージされて表示される場合は、編集タブにアクセスし、コングロマリット スパインを選択し、[選択を非表示] をクリックして評価します。確認された場合は、編集タブで「選択内容を表示」を選択し、分割してスパインを分離します。すべての背骨が視覚的に識別され、正しく描かれたら、[背骨]タブに移動して[すべて分類]を選択し、それらを細い、キノコ、ずんぐりした、糸状に分類します。
すべての脊椎の検出と分類が完了したら、3D環境ウィンドウの上部ツールバーで、Neurolucida Explorerの「保存して表示」を選択し、トレースから収集したデータを保存します。[Explorer]ウィンドウ内で、[view]タブに移動し、[Select all]を左クリックして、すべての樹状突起とスパインを強調表示します。次に、上部ツールバーにある[分析]タブに進みます。
[Structure]ドロップダウンメニューを左クリックし、[Branch Structure Analysis]を選択して、強調表示された要素の詳細な構造解析を開始します。スパイン密度と平均スパイン体積の分析では、各樹木と各樹状突起を選択します。次に、「Spines」をクリックし、「Spine Details」をクリックして分析を実行すると、結果が2つの異なるウィンドウに表示されます。
