まず、ピペットを使用して、薄層クロマトグラフィー(TLC)プレートの一番下の線にマークされたドットに、各抽出物の5マイクロリットルを2センチ間隔で見つけます。TLCプレート上でスポットを乾かし、各抽出物の約5ミリグラムがプレートにロードされるまで繰り返します。TLC現像タンクでジクロロメタンとメタノールの1:2溶液を調製します。
TLCプレートを現像タンクに入れ、プレートの上部から2cmのところに溶媒が到達するまで現像します。開発が完了したら、TLCプレートをタンクから取り外します。すぐに、溶媒線の上の点のポジティブコントロールを見つけます。
すべての溶媒が蒸発する前に、プレートをエタノール滅菌したTLCプレートボックスに入れます。滅菌金属ヘラを使用して、5つの病原体プレートの菌糸体マットをこすり落とします。次に、50ミリリットルの遠心分離管に移します。
寒天で修正した25ミリリットルのポテトデキストロースブロスを追加した後、滅菌ガラスビーズをチューブに加え、5分間渦巻いて菌糸体マットを壊します。クロマトグラフィー噴霧器をフードに組み立てた後、チューブを取り付けます。次に、流量計をセットアップに取り付けます。
菌糸体懸濁液を針先付きの滅菌シリンジを使用してクロマトグラフィー噴霧器に移し、大きな菌糸体が噴霧器を詰まらせないようにします。以前に開発したTLCプレートを層流フードの滅菌ペーパータオルに置き、プレートとの手の接触を減らしながら、メディア懸濁液を適用します。病原体サンプルを組み立てた噴霧器に接続し、懸濁液をTLCプレートに3回塗布して、塗布の合間にプレートを完全に乾燥させます。
次に、滅菌したプラスチックプレートボックスに50ミリリットルの滅菌水を加えて、インキュベーションセットアップを準備します。TLCプレートを座らせるために、その中に4枚のペトリプレートを置きます。また、滅菌した折り畳みセルロースシートまたは濾紙を箱の両側に置き、水分を保持します。
完成したアッセイプレートを、箱の中の4つの空のシャーレに置きます。アッセイを3日間から1週間、またはポジティブコントロールと阻害ゾーンの周囲を除いて、菌糸体の均一な層がプレート全体に成長するまでインキュベートします。次に、金属スプーンを使用して、シリカを阻害ゾーンからこすり落とし、マイクロ遠心チューブに入れます。
各チューブとボルテックスに500マイクロリットルのメタノールを加えて、シリカから代謝物を抽出します。チューブを遠心分離してシリカをペレット化し、上清を液体クロマトグラフィーバイアルに移して分析します。紫外線下でのイメージングにより、TLCプレート上の代謝物の分離が示されました。
インキュベーション後、病原体は、ポジティブコントロールと阻害ゾーンを除いて、プレート全体に均一に増殖しているように見えました。
