磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを用いたマウスナイーブCD4⁺ T細胞の精製と解析

まず、0.1〜2ミリリットルの容量で1×10の8細胞/ミリリットルの累乗でマウス脾細胞単細胞懸濁液を調製します。50マイクロリットルのラット血清をサンプルに加えます。サンプルを5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに移します。

サンプルに50マイクロリットルのアイソレーションカクテルを追加します。よく混合し、室温で7.5分間インキュベートします。次に、枯渇カクテルのミリリットルあたり50マイクロリットルを追加します。

よく混ぜて2.5分間インキュベートします。その間、磁気ビーズを渦巻きにして、均一な分散を確保します。75マイクロリットルの磁気ビーズをサンプルに加えます。

よく混ぜて2.5分間インキュベートします。RPMI 1640中程度から最終容量2.5ミリリットルまでサンプルを補充し、数回混合します。次に、チューブを磁石に2.5分間入れます。

磁石を手に取り、チューブで1回の連続動作で反転させ、濃縮された細胞懸濁液を新しいチューブに注ぎます。血球計算盤を使用して細胞数を決定します。ナイーブCDの4陽性T細胞の単離前および単離後のフローサイトメトリー解析を実施します。

ゲーティング後、細胞懸濁液を新しい遠心分離チューブに移します。400Gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを200〜500マイクロリットルのRPMI 1640培地に10%FBSを補充して再懸濁します。

細胞培養物1ミリリットルごとに、白血球活性化カクテルを2マイクロリットル加えて混ぜる。二酸化炭素インキュベーターで、飽和湿度37°Cで細胞を4〜6時間培養します。