まず、解剖顕微鏡下でパラフィン紙の上にフォーマルで固定されたマウスの目を置きます。一対のマイクロ鉗子で、筋肉と視神経の残骸を保持します。次に、角膜が片側を向くように目を向けます。
次に、外科用ブレードを使用して、リンバスの後ろと平行に1〜2ミリメートルの長さの切開を行います。前眼部が後端から分離するまで、目を所定の位置に保持しながら、ブレードで下向きの力を加えます。次に、前眼部とレンズを廃棄します。
後部をPBSで満たされた6センチメートルの皿に移します。マイクロスパチュラを使用して網膜をすくい取り、同時にマイクロ鉗子で視神経を保持します。網膜をすすぐには、網膜を二重蒸留水で満たされた6つのウェルがある12ウェルプレートのウェルに移します。
P1000ピペットを使用して、網膜に隣接する水を慎重に上下にピペットで動かし、水を吹き付けて穏やかに攪拌します。次に、倒立ガラスピペットを使用して、網膜を2番目のウェルに移します。網膜を消化するには、すすぎた網膜を倒立ガラスピペット付きの12ウェルプレートのトリプシン溶液に移します。
トリプシンを染み込ませたP200ピペットチップを視神経の中央に配置します。次に、血管ネットワーク全体をゆっくりと上下にピペットで動かし、非血管組織を解離します。次に、トリプシンであらかじめすすいだ逆ガラスピペットを使用して、網膜血管系を6ウェルプレート内の二重蒸留水を含むウェルに移します。
プレートを回転させ、逆トリプシンすすぎガラスピペットで血管系を上下にピペットで動かし、残っている非血管組織を除去します。網膜血管系を荷電した表面顕微鏡スライド上のマークされた領域の中心に慎重に移します。次に、P200ピペットを使用して、一方の端から余分な水分を慎重に取り除きます。
スライドを前面に近いバイオセーフティキャビネットに置き、残留水を蒸発させます。血管系がほぼ乾いたら、位相差顕微鏡で移します。P200ピペットを使用して、マークされた領域の片側に二重蒸留水をゆっくりと追加し、血管系を慎重に再水和します。
単離された網膜血管系の固定により、AFM測定に適した構造的に堅牢で十分に耐久性のある組織が得られました。対照的に、固定されていない眼または一時的に固定された眼から分離された網膜血管は断片化して崩壊しました。
